仿製藥質量再評價最新進展：CFDA發布三大指導原則

hjc黄金城仿製藥質量一致性評價

“仿製藥質量一致性評價”主要針對2007年新版《藥品注冊管理辦法》頒布實施之前批準的口服仿製藥，主要包括片劑、膠囊劑和顆粒劑等，進行質量再評價。評價要求考察國內企業生產的產品與原研產品在溶出度和有關物質等關鍵質量指標上是否一致。如果質量不一致，則要求企業對產品進行處方工藝改進。
考慮到國內仿製藥質量大多數達不到原研產品的水平，因此“質量一致性評價”的具體業務一般包括兩個部分：
1. 對企業產品的溶出度和有關物質與參比製劑進行對比，根據研究數據判斷兩者質量是否一致。
2. 如果質量不一致，則需要按照仿製藥研發的要求，對該產品的處方工藝進行重新開發，將開發好的新處方工藝移交給企業並且支持企業進行申報。

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附征求意見稿全文：
1.普通口服固體製劑參比製劑選擇和確定指導原則（征求意見稿）
2.普通口服固體製劑溶出曲線測定與比較指導原則（征求意見稿）
3.仿製藥質量一致性評價人體生物等效性研究技術指導原則（征求意見稿）

普通口服固體製劑參比製劑選擇和確定指導原則
一、概述
為推進仿製藥與原研藥品質量和療效一致性評價工作的開展，根據《國務院關於改革藥品醫療器械審評審批製度的意見》（國發〔2015〕44號）要求，製定本指導原則。
仿製藥是指與被仿製藥具有相同的活性成分、劑型、給藥途徑和治療作用的藥品。
參比製劑是指用於仿製藥質量一致性評價的對照藥品，可為原研藥品或國際公認的同種藥物。
原研藥品是指在全球市場率先上市的，擁有或曾經擁有相關專利、或獲得了專利授權的原創性藥品。
國際公認的同種藥物是指在歐盟、美國獲準上市並獲得參比製劑地位的仿製藥。
原研藥品和國際公認的同種藥物通常具有完善的臨床研究數據或生物等效性研究數據。
本指導原則適用於普通口服固體製劑仿製藥質量一致性評價研究用參比製劑的選擇與備案。

二、選擇原則參比製劑首選原研藥品，若確實無法獲得原研藥品或有證據證明原研藥品不適合評價方法要求時，也可以選用國際公認的同種藥物作為參比製劑。
（一）首選國內上市的原研藥品作為參比製劑。如原研企業同時有進口和地產化藥品的上市許可，優先選擇進口原研藥品作為參比製劑。若原研藥品未在國內上市，可選擇在國外上市的原研藥品。優先選擇在歐盟、美國上市並被列為參比製劑的原研藥品。
（二）國際公認的同種藥物首選國內上市藥品。如企業同時有進口和地產化藥品的上市許可，優先選擇進口藥品作為參比製劑。若國際公認的同種藥物未在國內上市，則選擇在歐盟、美國上市並被列為參比製劑的同種藥物。
（三）參比製劑的質量及均一性應滿足藥品評價要求。

三、產生方式
（一）藥品生產企業應按照上述要求，明確所產仿製藥的參比製劑，報食品藥品監管總局備案。
（二）行業協會可以組織同品種企業提出參比製劑的意見，報食品藥品監管總局審核確定。
（三）食品藥品監管總局可以推薦參比製劑，供藥品生產企業參考。

四、備案和審核
（一）藥品生產企業應根據國家仿製藥質量一致性評價的任務要求和擬評價品種的情況，開展先期研究，擬定參比製劑，填寫參比製劑備案申請表，報食品藥品監督管理總局備案。食品藥品監督管理總局如有異議，應當在接到備案文件20個工作日內作出。
（二）當參比製劑難以確定時，企業應將相關情況和建議報食品藥品監督管理總局，經征詢專家意見後審核確定。
（三）由行業協會提出和總局推薦的參比製劑，經征詢專家意見後審核確定。

五、參比製劑的研究
（一）通過備案或審核確定的參比製劑，由企業自行購買，並對參比製劑開展研究。
（二）參比製劑應有合法或明確來源，其批次和數量應滿足企業仿製藥質量一致性評價研究及藥品檢驗機構檢驗複核的需求。
（三）企業應對參比製劑和仿製藥開展全麵對比研究。

普通口服固體製劑溶出曲線測定與比較指導原則
一、概述
為進一步推進仿製藥與原研藥品質量和療效一致性評價工作的開展，根據《國務院關於改革藥品醫療器械審評審批製度的意見》（國發〔2015〕44號）要求，製定本指導原則。本指導原則適用於仿製藥質量一致性評價中普通口服固體製劑溶出曲線測定方法的建立和溶出曲線相似性的比較。

二、背景
固體製劑口服給藥後，藥物的吸收取決於藥物從製劑中的溶出或釋放、藥物在生理條件下的溶解以及在胃腸道的滲透等，因此，藥物的體內溶出和溶解對吸收具有重要影響。
體外溶出試驗常用於指導藥物製劑的研發、評價製劑批內批間質量的一致性、評價藥品處方工藝變更前後質量和療效的一致性等。
普通口服固體製劑，可采用比較仿製製劑與參比製劑體外多條溶出曲線相似性的方法，評價仿製製劑的質量。溶出曲線的相似並不意味著兩者一定具有生物等效，但該法可降低兩者出現臨床療效差異的風險。

三、溶出試驗方法的建立
溶出試驗方法應能客觀反映製劑特點、具有適當的靈敏度和區分力。可參考有關文獻，了解藥物的溶解性、滲透性、pKa常數等理化性質，考察溶出裝置、介質、攪拌速率和取樣間隔期等試驗條件，確定適宜的試驗方法。
（一）溶出儀
溶出儀需滿足相關的技術要求，應能夠通過機械驗證及性能驗證試驗。必要時，可對溶出儀進行適當改裝，但需充分評價其必要性和可行性。溶出試驗推薦使用槳法、籃法，一般槳法選擇50～75轉/分鍾，籃法選擇50～100轉/分鍾。在溶出試驗方法建立的過程中，轉速的選擇推薦由低到高。若轉速超出上述規定應提供充分說明。
（二）溶出介質
溶出介質的研究應根據藥物的性質，充分考慮藥物在體內的環境，選擇多種溶出介質進行，必要時可考慮加入適量表麵活性劑、酶等添加物。
1.介質的選擇
應考察藥物在不同pH值溶出介質中的溶解度，推薦繪製藥物的pH-溶解度曲線。在確定藥物主成分穩定性滿足測定方法要求的前提下，推薦選擇不少於3種pH值的溶出介質進行溶出曲線考察，如選擇pH值1.2、4.5和6.8的溶出介質。對於溶解度受pH值影響大的藥物，可能需在更多種pH值的溶出介質中進行考察。推薦使用的各種pH值溶出介質的製備方法見附件1。當采用pH7.5以上溶出介質進行試驗時，應提供充分的依據。水可作為溶出介質，但使用時應考察其pH值和表麵張力等因素對藥物及輔料的影響。
2.介質體積
推薦選擇500ml、900ml或1000ml。
（三）溶出曲線的測定
1.溶出曲線測定時間點的選擇取樣時間點可為5和/或10、15和/或20、30、45、60、90、120分鍾，此後每隔1小時進行測定。
2.溶出曲線考察截止時間點的選擇以下任何一個條件均可作為考察截止時間點選擇的依據。
（1）連續兩點溶出量均達85%以上，且差值在5%以內。a.一般在酸性溶出介質(pH1.0～3.0)中考察時間不超過2小時。（？）
（2）在其他各pH值溶出介質中考察時間不超過6小時。
（四）溶出條件的優化
在截止時間內，藥物在所有溶出介質中平均溶出量均達不到85%時，可優化溶出條件，直至出現一種溶出介質達到85%以上。優化順序為提高轉速，加入適量的表麵活性劑、酶等添加物。表麵活性劑濃度推薦在0.01％～1.0%(W/V)範圍內依次遞增，特殊品種可適度增加濃度。某些特殊藥品的溶出介質可使用人工胃液和人工腸液。
（五）溶出方法的驗證
方法建立後應進行必要的驗證，如：準確度、精密度、專屬性、線性、範圍和耐用性等。

四、溶出曲線相似性的比較
溶出曲線相似性的比較，多采用非模型依賴法中的相似因子（f2）法。該法溶出曲線相似性的比較是將受試樣品的平均溶出量與參比樣品的平均溶出量進行比較。平均溶出量應為12片（粒）的均值。計算公式： Rt為t時間參比樣品平均溶出量；Tt為t時間受試樣品平均溶出量；n為取樣時間點的個數。
（一）采用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性的要求相似因子（f2）法最適合采用3～4個或更多取樣點且應滿足下列條件：
1.應在完全相同的條件下對受試樣品和參比樣品的溶出曲線進行測定。
2.兩條溶出曲線的取樣點應相同。時間點的選取應盡可能以溶出量等分為原則，並兼顧整數時間點，且溶出量超過85%的時間點不超過1個。
3.第1個時間點溶出結果的相對標準偏差不得過20%，自第2個時間點至最後時間點溶出結果的相對標準偏差不得過10%。
（二）溶出曲線相似性判定標準
1.采用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性時，一般情況下，當兩條溶出曲線相似因子（f2）數值不小於50時，可認為溶出曲線相似。
2.當受試樣品和參比樣品在15分鍾的平均溶出量均不低於85%時，可認為溶出曲線相似。

五、其他
（一）溶出曲線相似性的比較應采用同劑型、同規格的製劑。
（二）當溶出曲線不能采用相似因子（f2）法比較時，可采用其他適宜的比較法，但在使用時應給予充分論證。
附：溶出介質製備方法（略）

以上為推薦采用的溶出介質配製方法，如有必要，研究者也可根據具體情況采用其他的溶出介質以及相應的配製方法。

仿製藥質量一致性評價人體生物等效性研究技術指導原則
一、概述
藥物製劑要產生最佳療效，其藥物活性成分應當在預期時間段內釋放吸收並被轉運到作用部位達到預期的有效濃度。大多數藥物是進入血液循環後產生全身治療效果的，作用部位的藥物濃度和血液中藥物濃度存在一定的比例關係，因此可以通過測定血液循環中的藥物濃度來獲得反映藥物體內吸收程度和速度的主要藥代動力學參數，間接預測藥物製劑的臨床治療效果，以評價製劑的質量。允許這種預測的前提是製劑中活性成分進入體內的行為是一致並且可重現的。
生物利用度（Bioavailability,BA）是反映藥物活性成分吸收進入體內的程度和速度的指標。過去出現的一些由於製劑生物利用度不同而導致的不良事件，使人們認識到確有必要對製劑中活性成分生物利用度的一致性或可重現性進行驗證，尤其是在含有相同活性成分的仿製產品要替代它的原研製劑進入臨床使用的時候。鑒於藥物濃度和治療效果相關，假設在同一受試者，相同的血藥濃度-時間曲線意味著在作用部位能達到相同的藥物濃度，並產生相同的療效，那麽就可以藥代動力學參數作為替代的終點指標來建立等效性，即生物等效性（Bioequivalence, BE）。BA和BE研究已經成為評價製劑質量的重要手段。
本指導原則將重點闡述BA和BE研究的相關概念、應用範圍和BA和BE研究的設計、操作和評價等。
本指導原則主要是針對化學藥品普通固體口服製劑質量一致性評價的人體生物等效性研究。
因為在具體應用過程中有可能麵臨多種情況，對於一些特殊問題，仍應遵循具體問題具體分析的原則。

二、BA和BE基本概念及應用
1.生物利用度：是指藥物活性成分從製劑釋放吸收進入全身循環的程度和速度。一般分為絕對生物利用度和相對生物利用度。絕對生物利用度是以靜脈製劑（通常認為靜脈製劑生物利用度為100%）為參比製劑獲得的藥物活性成分吸收進入體內循環的相對量；相對生物利用度則是以其他非靜脈途徑給藥的製劑（如片劑和口服溶液）為參比製劑獲得的藥物活性成分吸收進入體循環的相對量。
2.生物等效性：是指藥學等效製劑或可替換藥物在相同試驗條件下，服用相同劑量，其活性成分吸收程度和速度的差異無統計學意義。通常意義的BE研究是指用BA研究方法，以藥代動力學參數為終點指標，根據預先確定的等效標準和限度進行的比較研究。在藥代動力學方法確實不可行時, 也可以考慮以臨床綜合療效、藥效學指標或體外試驗指標等進行比較性 研究，但需充分證實所采用的方法具有科學性和可行性。

了解以下幾個概念將有助於理解 BA和BE：
原研藥（Innovator Product）：是指已經過全麵的藥學、藥理學和毒理學研究以及臨床研究數據證實其安全有效性並首次被批準上市的藥品。
藥學等效性(Pharmaceutical equivalence)：如果兩製劑含等量的相同活性成分，具有相同的劑型，符合同樣的或可比較的質量標準，則可以認為它們是藥學等效的。藥學等效不一定意味著生物等效，因為輔料的不同或生產工藝差異等可能會導致藥物溶出或吸收行為的改變。
治療等效性(Therapeutic equivalence)：如果兩製劑含有相同活性成分，並且臨床上顯示具有相同的安全性和有效性，可以認為兩製劑具有治療等效性。如果兩製劑中所用輔料本身並不會導致有效性和安全性問題，生物等效性研究是證實兩製劑治療等效性最合適的辦法。如果藥物吸收速度與臨床療效無關,吸收程度相同但吸收速度不同的藥物也可能達到治療等效。而含有相同的活性成分隻是活性成分化學形式不同（如某一化合物的鹽、酯等）或劑型不同（如片劑和膠囊劑）的藥物製劑也可能治療等效。
基本相似藥物（Essentially similar product）：如果兩個製劑具有等量且符合同一質量標準的藥物活性成分，具有相同劑型，並且經過證明具有生物等效性,則兩個製劑可以認為是基本相似藥物。從廣義上講，這一概念也應適用於含同一活性成分的不同的劑型，如片劑和膠囊劑。與原研藥基本相似藥物是可以替換原研藥使用的。

BA和BE均是評價製劑質量的重要指標，BA強調反映藥物活性成分到達體內循環的相對量和速度，是新藥研究過程中選擇合適給藥途徑和確定用藥方案(如給藥劑量和給藥間隔)的重要依據之一。BE則重點在於以預先確定的等效標準和限度進行的比較，是保證含同一藥物活性成分的不同製劑體內行為一致性的依據，是判斷後研發產品是否可替換已上市藥品使用的依據。

BA和BE研究在藥品研發的不同階段有不同作用：在新藥研究階段，為了確定新藥處方、工藝合理性，通常需要比較改變上述因素後製劑是否能達到預期的生物利用度；開發了新劑型，要對擬上市劑型進行生物利用度研究以確定劑型的合理性，通過與原劑型比較的BA研究來確定新劑型的給藥劑量，也可通過BE研究來證實新劑型與原劑型是否等效；在臨床試驗過程中，可通過BE研究來驗證同一藥物的不同時期產品的前後一致性，如：早期和晚期的臨床試驗用藥品，臨床試驗用藥品（尤其是用於確定劑量的試驗藥）和擬上市藥品等。在仿製生產已有國家標準藥品時，可通過BE研究來證明仿製產品與原研藥是否具有生物等效性，是否可與原研藥替換使用。

藥品批準上市後，如處方組成成分、比例以及工藝等出現一定程度的變更時，研究者需要根據產品變化的程度來確定是否進行BE研究，以考察變更後和變更前產品是否具有生物等效性。以提高生物利用度為目的研發的新製劑，需要進行BA研究，了解變更前後生物利用度的變化。

三、研究方法
BE研究是在試驗製劑和參比製劑生物利用度比較基礎上建立等效性。目前推薦的生物等效性研究方法包括體內和體外的方法。按方法的優先考慮程度從高到低排列：藥代動力學研究方法、藥效動力學研究方法、臨床比較試驗方法、體外研究方法。具體如下：
藥代動力學研究：即采用人體生物利用度比較研究的方法。通過測量不同時間點的生物樣本（如全血、血漿、血清或尿液）中藥物濃度，獲得藥物濃度-時間曲線（Concentration-Time curve, C-T）來反映藥物從製劑中釋放吸收到體循環中的動態過程。並經過適當的數據，得出與吸收程度和速度有關的藥代動力學參數如曲線下麵積（AUC）、達峰濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）等，通過統計學比較以上參數，判斷兩製劑是否生物等效。
藥效動力學研究：在無可行的藥代動力學研究方法建立生物等效性研究時（如無靈敏的血藥濃度 檢測方法、濃度和效應之間不存在線性相關），可以考慮用明確的可分級定量的人體藥效學指標通過效應-時間曲線（Effect-Time curve）與參比製劑比較來確定生物等效性。
臨床比較試驗：當無適宜的藥物濃度檢測方法，也缺乏明確的藥效學指標時，也可以通過以參比製劑為對照的臨床比較試驗，以綜合的療效終點指標來驗證兩製劑的等效性。然而，作為生物等效研究方法，對照的臨床試驗可能因為樣本量不足或檢測指標不靈敏而缺乏足夠的把握度去檢驗差異，故建議盡量采用藥代動力學研究方法。通過增加樣本量或嚴格的臨床研究實施在一定程度上可以克服以上局限。
體外研究：一般不提倡用體外的方法來確定生物等效性，因為體外並不能完全代替體內行為，但在某些情況下，如能提供充分依據，也可以采用體外的方法來證實生物等效性。根據生物藥劑學分類證明屬於高溶解度，高滲透性，快速溶出的口服製劑可以采用體外溶出度比較研究的方法驗證生物等效，因為該類藥物的溶出、吸收已經不是藥物進入體內的限速步驟。對於難溶性但高滲透性的藥物，如已建立良好的體內外相關關係，也可用體外溶出的研究來替代體內研究。

四、BE研究具體要求
以藥代動力學參數為終點指標的研究方法是目前普遍采用的生物等效性研究方法。一個完整的生物等效性研究包括生物樣本分析、實驗設計、統計分析、結果評價四個方麵內容。
（一）生物樣本分析方法的建立和確證生物樣品一般來自全血、血清、血漿、尿液或其他組織，具有取樣量少、藥物濃度低、幹擾物質多以及個體的差異大等特點，因此必須根據待測物的結構、生物介質和預期的濃度範圍，建立適宜的生物樣品定量分析方法，並對方法進行確證。1.常用分析方法 目前常用的幾種分析方法有：
（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質譜聯用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用於大多數藥物的檢測；
（2）免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用於蛋白質多肽類物質檢測；
（3）微生物學方法：可用於抗生素藥物的測定。生物樣本分析方法的選擇宜盡量選擇可行的靈敏度高的方法。

2.方法學確證（Method Validation）
建立可靠的和可重現的定量分析方法是進行生物等效性研究的關鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須進行充分的方法確證，一般應進行以下幾方麵的考察：
2.1 特異性(Specificity)
特異性是指樣品中存在幹擾成分的情況下，分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力。必須提供證明所測定物質是受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物，生物樣品所含內源性物質和相應代謝物、降解產物不得幹擾對樣品的測定，如果有幾個分析物，應保證每一個分析物都不被幹擾。應確定保證分析方法特異性的最佳檢測條件。對於色譜法至少要考察6個來自不同個體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖（注明濃度）及用藥後的生物樣品色譜圖反映分析方法的特異性。對於以軟電離質譜為基礎的檢測法（LC－MS、LC-MS-MS）應注意考察分析過程中的介質效應，如離子抑製等。
2.2 標準曲線和定量範圍（Calibration Curve）

標準曲線反映了所測定物質濃度與儀器響應值之間的關係，一般用回歸分析方法（如用加權最小二乘法）所得的回歸方程來評價。應提供標準曲線的線性方程和相關係數，說明其線性相關程度。標準曲線高低濃度範圍為定量範圍，在定量範圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。配製標準樣品應使用與待測樣品相同生物介質，不同生物樣品應製備各自的標準曲線，用於建立標準曲線的標準濃度個數取決於分析物可能的濃度範圍和分析物/響應值關係的性質。必須至少用6個濃度建立標準曲線，對於非線性相關可能需要更多濃度點。定量範圍要能覆蓋全部待測的生物樣品濃度範圍，不得用定量範圍外推的方法求算未知樣品的濃度。建立標準曲線時應隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點，僅用於評價幹擾。標準曲線各濃度點的實測值與標示值之間的偏差*在可接受的範圍之內時，可判定標準曲線合格。可接受範圍一般規定為最低濃度點的偏差在±20%以內，其餘濃度點的偏差在±15%以內。隻有合格的標準曲線才能對臨床待測樣品進行定量計算。當線性範圍較寬的時候，推薦采用加權的方法對標準曲線進行計算，以使低濃度點計算得比較準確。（注：*偏差=【（實測值－標示值）/標示值】X100%）

2.3 定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）定量下限是標準曲線上的最低濃度點，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。LLOQ應能滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1／10～1/20時的藥物濃度。其準確度應在真實濃度的80%～120%範圍內，相對標準差(RSD)應小於20%。應至少由5個標準樣品測試結果證明。

2.4 精密度與準確度(Precision and Accuracy)精密度是指在確定的分析條件下，相同介質中相同濃度樣品的一係列測量值的分散程度。通常用質控樣品的批內和批間RSD來考察方法的精確度。一般RSD應小於15％，在LLOQ附近 RSD應小於20％。準確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的 接近程度(即質控樣品的實測濃度與真實濃度的偏差)，重複測定已知濃度分析物樣品可獲得準確度。一般應85％～115％範圍內，在LLOQ附近應在80％～120％範圍內。一般要求選擇高、中、低3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考察。低濃度選擇在LLOQ的3倍以內，高濃度接近於標準曲線的上限，中間選一個濃度。在測定批內精密度時，每一濃度至少製備並測 定5個樣品。為獲得批間精密度應至少在不同天連續製備並測定3個合格的分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少45個樣品。
2.5 樣品穩定性(Stability)
根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進行穩定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意考察儲備液的穩定性以及樣品處理後的溶液中分析物的穩定性，以保證檢測結果的準確性和重現性。
2.6 提取回收率
從生物樣本基質中回收得到分析物質的響應值除以純標準品產生的響應值即為分析物的提取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例。應考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結果應當精密和可重現。
2.7 微生物學和免疫學方法確證
上述分析方法確證主要針對色譜法，很多參數和原則也適用於微生物學或免疫學分析，但在方法確證中應考慮到它們的一些特殊之處。微生物學或免疫學分析的標準曲線本質上是非線性的，所以應盡可能采用比化學分析更多的濃度點來建立標準曲線。結果的準確度是關鍵的因素，如果重複測定能夠改善準確度，則應在方法確證和未知樣品測定中采用同樣的步驟。

3.方法學質控
隻有在生物樣本分析方法確證完成之後才能開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應進行質量控製，以保證所建立的方法在實際應用中的可靠性。推薦由獨立的人員配製不同濃度的質控樣品對分析方法進行考核。
每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行複測。生物等效性試驗中，來自同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。每個分析批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，並隨行測定高、中、低三個濃度的質控樣品。每個濃度至少雙樣本，並應均勻分布在未知樣品測試順序中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質控樣品數，使質控樣品數大於未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應小於15%，低濃度點偏差一般應小於20%，最多允許1/3的質控樣品結果超過上述限度，但不能出現在同一濃度質控樣品中。如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果作廢。
濃度高於定量上限的樣品，應采用相應的空白介質稀釋後重新測定。對於濃度低於定量下限的樣品，在進行藥代動力學分析時，在達到Cmax以前取樣的樣品應以零值計算，在達到Cmax以後取樣的樣品應以無法定 量（Not detectable, ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。

4.分析數據的記錄與保存分析方法的有效性應通過實驗證明。在臨床報告中，應提供完成這些實驗工作的相關的詳細資料。建立一般性和特殊性標準操作規程、保存完整的實驗記錄是分析方法有效性的基本要素。生物分析方法建立中產生的數據和質控樣品測試結果應全部記錄並妥善保存，並提供足夠的可供評價的方法學建立和樣品分析的數據。至少應當提供的數據包括：

4.1 方法建立的數據
分析方法的詳細描述；儀器設備、分析條件；該方法所用對照品（被 測藥物、代謝物、內標物）的純度和來源；描述測定特異性、準確度、精密度、回收率、定量限、標準曲線的實驗並給出獲得的主要數據列表；列出批內批間精密度和準確度的詳細結果；描述穩定性考察及相關數據；根據具體情況提供代表性的色譜圖或質譜圖並加以說明。

4.2 樣品分析的數據
樣品處理和保存的情況；分析樣品時標準曲線列表；用於計算結果的回歸方程；各分析批質控樣品測定結果綜合列表並計算批內和批間精密度、準確度；各分析批包括的未知樣品濃度計算結果。提供100%受試者樣品測試的色譜圖複印件，包括相應分析批的標準曲線和質控樣品的色譜圖複印件。注明缺失樣品的原因，重複測試的結果。對舍棄任何分析數據和選擇所報告的數據說明理由。

4.3 其他相關信息
項目編號、分析方法編號、分析方法類型、分析方法確證進行簡化的理由、以及相應的項目計劃編號、標題等。

（二）實驗設計與操作

1. 交叉設計
交叉設計是目前應用最多最廣的方法，因為多數藥物吸收和清除在個體之間均存在很大變異，個體間的變異係數遠遠大於個體內變異係數，因此生物等效性研究一般要求按自身交叉對照的方法設計。把受試對象隨機分為幾組，按一定順序處理，一組受試者先服用受試製劑，後服用參比製劑；另一組受試者先服用參比製劑，後服用受試製劑。兩順序間應有足夠長的間隔時間，為清洗期（Wash-out Period）。這樣，對每位受試者都連續接受兩次或更多次的處理，相當於自身對照，可以將製劑因素對藥物吸收的影響與其他因素區分開來，減少了不同試驗周期和個體間差異對試驗結果的影響。
根據試驗製劑數量不同一般采用2×2交叉、3×3交叉等設計。如果是兩種製劑比較，雙處理、雙周期，兩序列的交叉設計是較好的選擇。如試驗包括3個製劑（受試製劑2個和參比製劑1個）時，宜采用3製劑3周期二重3×3拉丁方試驗設計。各周期間也應有足夠的清洗期。設定清洗期是為了消除兩製劑的互相幹擾，避免上個周期內的處理影響到隨後一周期的處理中。清洗期一般不應短於7個消除半衰期。但有些藥物或其活性代謝物半衰期很長時則難以按此方法設計實施，在此情況下可能需要考慮按平行組設計進行，但樣本量可能要增加。而對於某些高變異性藥物（Highly Variable Drug），根據具體情況，除采用增加例數的辦法外，可采用重複交叉設計，對同一受試者兩次接受同一製劑時可能存在的個體內差異進行測定。

2.受試者的選擇
2.1 受試者入選條件：受試者的選擇應當盡量使個體間差異減到最小，以便能檢測出製劑間的差異。試驗方案中應明確入選和剔除條件。一般情況應選擇男性健康受試者。特殊作用的藥品，則應根據具體情況選擇適當受試者。選擇健康女性受試者應避免懷孕的可能性。如待測藥物存在已知的不良反應，可能帶來安全性擔憂，也可考慮選擇患者作為受試者。年齡:一般18～40周歲，同一批受試者年齡不宜相差10歲以上。體重：正常受試者的體重一般不應低於50kg。按體質指數(Body MassIndex , BMI)＝體重（kg）／身高2（m2）計算，一般應在標準體重範圍內。同一批受試者體重（kg）不宜懸殊過大，因為受試者服用的藥物劑量是相同的。受試者應經過全麵體檢，身體健康，無心、肝、腎、消化道、神經係統、精神異常及代謝異常等病史；體格檢查示血壓、心率、心電圖、呼吸狀況、肝、腎功能和血象無異常，避免藥物體內過程受到疾病幹擾。根據藥物類別和安全性情況，還應在試驗前、試驗期間、試驗後進行特殊項目檢查，如降糖藥應檢查血糖水平。為避免其他藥物幹擾，試驗前兩周內及試驗期間禁服任何其他藥物。實驗期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料，或某些可能影響代謝的果汁等，以免幹擾藥物體內代謝。受試者應無煙、酒嗜好。如有吸煙史，在討論結果時應考慮可能的影響。 如已知藥物存在遺傳多態性導致代謝差異，應考慮受試者由於慢代謝可能出現的安全性等問題。

2.2 受試者例數受試者例數應當符合統計學要求，對於目前的統計方法, 18—24例可滿足大多數藥物對樣本量的要求，但對某些變異性大的藥物可能需要適當增加例數。一個臨床試驗的例數多少是由三個基本因素決定的：
（1）顯著性水平：即α值的大小，通常取 0.05 或 5%；
（2）把握度：即1-β值的大小，一般定為不小於 80%，其中β是犯第Ⅱ類錯誤的概率，也就是把實際有效誤判為無效的概率；
（3）變異性（CV%）和差別（θ）：兩藥等效性檢驗中檢測指標的變異性和差別越大所需例數越多。在試驗前並不知道θ和CV%，隻能根據已有的參比製劑的上述參數來估算或進行預試驗。另外，當一個生物利用度試驗完成後，可以根據θ、CV%和把握度等參數來求N值，並與試驗所選擇例數進行對比，檢驗試驗所采用例數是否合適。

2.3 受試者分組
必須采用隨機方法分組，各組間應具有可比性。
3.受試製劑和參比製劑(Test Product and Reference Product ,T and R )
參比製劑的質量直接影響生物等效性試驗結果的可靠性，參比製劑的選擇應遵循總局仿製藥質量一致性評價工作辦公室發布的相關指導原則的要求。參比製劑和受試製劑含量差別不能超過5%。
對於受試製劑，應為符合現行質量標準的中試/生產規模的產品。應提供該製劑的體外溶出度、穩定性、含量或效價測定、批間一致性報告等，供試驗單位參考。個別藥物尚需提供多晶型及光學異構體的資料。參比製劑和受試製劑均應注明研製單位、批號、規格、保存條件、有效期。
試驗結束後受試製劑和參比製劑應保留足夠長時間直到產品一致性評價以備查。
4.給藥劑量
進行藥物製劑生物利用度和生物等效性研究時，給藥劑量一般應與臨床單次用藥劑量一致，不得超過臨床推薦的單次最大劑量或已經證明的安全劑量。受試製劑和參比製劑一般應服用相等劑量，需要使用不相等劑量時，應說明理由並提供所用劑量範圍內的線性藥代動力學特征依據，結果可以劑量校正方式計算生物利用度。
一般情況下普通製劑僅進行單劑量給藥研究即可,但在某些情況下可能需要考慮進行多次給藥研究，如：（1）受試藥單次服用後原形藥或活性代謝物濃度很低，難以用相應分析方法精密測定血藥濃度時；（2）受試藥的生物利用度有較大個體差異；（3）藥物吸收程度相差不大，但吸收速度有 較大差異；（4）緩控釋製劑。進行多次給藥研究應按臨床推薦的給藥方案給藥，至少連續3次測定穀濃度確定血藥濃度達穩態後選擇一個給藥間隔取樣進行測定，並據此計算生物利用度。
5.取樣
取樣點的設計對保證試驗結果可靠性及藥代動力學參數計算的合理性，均有十分重要的意義。通常應有預試驗或參考國內外的藥代文獻，為合理設計采樣點提供依據。應用血藥濃度測定法時，一般應兼顧到吸收相、平衡相（峰濃度）和消除相。
在藥物濃度—時間曲線各時相及預計達峰時間前後應有足夠采樣點，使濃度—時間曲線能全麵反應藥物在體內處置的全過程。服藥前應先取空白血樣。一般在吸收相部分取2—3個點，峰濃度附近至少需要3個點，消除相取3—5個點。盡量避免第一個點即為Cmax，預試驗將有助於避免這個問題。采樣持續到受試藥原形或其活性代謝物3～5個半衰期時，或至血藥濃度為Cmax的1/10～1/20, AUC0-t/AUC0-∞通常應當大於80%。對於長半衰期藥物，應盡可能取樣持續到足夠比較完整的吸收過程，因為末端消除項對該類製劑吸收過程的評價影響不大。多次給藥研究中，對於一些已知生物利用度受晝夜節律影響的藥物，則應該連續24小時取樣。
當受試藥不能用血藥濃度測定方法進行生物利用度檢測時，若該藥原形或活性代謝物主要由尿排泄（大於給藥劑量的70%），可以考慮尿藥法測定，以尿樣中藥物的累積排泄量來反映藥物攝入量。

試驗藥品和試驗方案
應當符合生物利用度測定要求。尿樣的收集采用分段收集法,其采集頻度、間隔時間應滿足估算受試藥原形藥或活性代謝物經尿的排泄程度。但該方法不能反映藥物吸收速度，誤差因素較多，一般不提倡采用。某些藥物在體內迅速代謝無法測定生物樣品中原形藥物，也可采用測定生物樣品中主要代謝物濃度的方法，進行生物利用度和生物等效性試驗。

6.藥代動力學參數計算
一般用非房室數學模型分析方法來估算藥代動力學參數。用房室模型方法估算藥代參數時，采用不同的方法或軟件其值可能有較大差異。研究者可根據具體情況選擇使用，但所用軟件必須經確證並應在研究報告中注明所用軟件。在生物等效性研究中，其主要測量參數Cmax和Tmax均以實 測值表示。AUC0→t以梯形法計算，故受數據處理程序影響不大。

7.研究過程標準化
整個研究過程應當標準化，以使得除製劑因素外，其他各種因素導致的體內藥物釋放吸收差異減少到最小，包括受試者的飲食、活動都應控製。試驗工作應在I期臨床試驗觀察室進行。受試者應得到醫護人員的監護。受試期間發生的任何不良反應，均應及時處理和記錄，必要時停止試驗。

（三）數據處理及統計分析
1.數據表達BA和BE研究必須提供所有受試者各個時間點受試製劑和參比製劑的 藥物濃度測定數據、每一時間點的平均濃度（Mean）及其標準差（SD）和相對標準差（RSD），提供每個受試者的濃度—時間曲線（C-T曲線）和平均C-T曲線以及C-T曲線各個時間點的標準差。不能隨意剔除任何數據。脫落者的數據一般不可用其他數據替代。

2.藥代動力學參數
2.1 單次給藥的BA和BE研究，提供所有受試者服用受試製劑和參比製劑的AUC0→t，AUC0→∞、Cmax、Tmax、t1/2、CL、Vd、F等參數及其平均值和標準差。 Cmax和Tmax均以實測值表示。AUC0→t以梯形法計算；AUC0→∞按公式計算：AUC0→∞＝AUC0→t＋Ct/λz（t為最後一次可實測血藥濃度的采樣時間；Ct為末次可測定樣本藥物濃度；λz係對數濃度-時間曲線末端直線部份求得的末端消除速率常數，可用對數濃度-時間曲線末端直線部分的斜率求得；t1/2用公式 t1/2＝0.693／λz計算。以各個受試者受試製劑（T）和參比製劑（R）的AUC0→t按下式分別計算其相對生物利用度（F）值：當受試製劑和參比製劑劑量相同時：F＝AUCT／AUCR×100％ 受試製劑和參比製劑劑量不同時，若受試藥物具備線性藥代動力學特征，可按下式以劑量予以校正：F＝【AUCT×DR／AUCR×DT】×100％（AUCT、AUCR 分別為T和R的AUC；DR、DT分別為T和R的劑量）。

2.2 對於多次給藥的BA和BE研究，提供受試製劑和參比製劑的三次穀濃度數據（Cmin），達穩態後的AUCss Css-max、Css-min 、T ss-max、t1/2、F、DF等參數。當受試製劑與參比製劑劑量相等時，F值按下式計算：F＝AUCss T／AUCss R×100％（式中AUCss T和AUCss R 分別為T和R穩態條件下的AUC）3.統計分析

3.1 對數轉換
評價BE的藥代動力學參數AUC0→t和Cmax在進行等效性檢驗前必須作對數轉換。當數據有偏倚時經對數轉換可校正其對稱性。此外,統計中數據對比宜用比值法而不用差值法,通過對數轉換,可實現將均值之比置信區間轉換為對數形式的均值之差的計算。

3.2 等效判斷標準當前普遍采用主要藥代參數經對數轉換後以多因素方差分 析（ANOVA）進行顯著性檢驗，然後用雙單側t檢驗和計算90％置信區間的統計分析方法來評價和判斷藥物間的生物等效性。方差檢驗是顯著性檢驗，設定的無效假設是兩藥無差異，檢驗方式為是與否，在P<0.05時認為兩者差異有統計意義，但不一定不等效；P>0.05時認為兩藥差異無統計意義，但P>0.05並不能認為兩者相等或相近。在生物利用度試驗中，采用多因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，以判斷藥物製劑間、個體間、周期間和服藥順序間的差異。在生物等效性實驗中，方差分析可提示誤差來源，為雙單側t檢驗計算提供了誤差值（MSE）。
雙單側t檢驗及（1－2α）%置信區間法是目前生物等效檢驗的唯一標準。雙向單側t檢驗是等效性檢驗，設定的無效假設是兩藥不等效，受試製劑在參比製劑一定範圍之外，在P<0.05時說明受試製劑沒有超過規定的參比製劑的高限和低限，拒絕無效假設，可認為兩藥等效。
（1－2α）%置信區間是雙單側t檢驗另一種表達方式。其基本原理是在高、低2個方向對受試製劑的參數均值與高低界值之間的差異分別作單側t檢驗，若受試 製劑均數在高方向沒有大於等於參比製劑均數的125％（P＜0.05），且在低方向也沒有小於等於參比製劑均數的80％（P＜0.05），即在兩個方向的單側t檢驗，都能以95％的置信區間確認沒有超出規定範圍，則可認為受試製劑與參比製劑生物等效。
等效判斷標準，一般規定，經對數轉換後的受試製劑的 AUC0→t在參比製劑的80％—125％範圍，受試製劑的Cmax在參比製劑的80％—125％範圍。根據雙單側檢驗的統計量，同時求得（1－2α）%置信區間，如在規定範圍內，即可有1－2α的概率判斷兩藥生物等效。如有必要時，應對Tmax經非參數法檢驗，如無差異，可以認定受試製劑與參比製劑生物等效。

（四）結果評價
生物等效性是指一種藥物的不同製劑在相同的實驗條件下，給予相同劑量，其吸收程度和吸收速度沒有明顯差異。故對受試製劑與參比製劑的生物等效性評價，應從藥物吸收程度和吸收速度兩方麵進行，評價反映這兩方麵的3個藥代動力學參數即 AUC0→t、Cmax和Tmax是否符合前述等效標準。目前比較肯定AUC對藥物吸收程度的衡量作用，而Cmax、Tmax依賴取樣時間的安排，用它們衡量吸收速率有時是不夠準確的，不適合用於具有多峰現象的製劑及個體變異大的實驗。故在評價時，若出現某些不等效特殊情況，需具體問題加以具體分析。
對於 AUC，一般要求90％可信區間在80％—125％範圍內。對於治療窗窄的藥物，這個範圍可能應適當縮小，而在極少數情況下，如果經臨床證實合理的情況下，也可以適當放寬範圍。對 Cmax也是如此。而對於Tmax，一般在釋放快慢與臨床療效和安全性密切相關時需要統計評價，其等效範圍可根據臨床要求來確定。對於出現受試製劑生物利用度高於參比製劑的情況，即所謂超生物利用，可以考慮兩種情況：
1）參比製劑是否本身生物利用度低的產品，因而受試製劑表現出生物利用度相對較高；
2）參比製劑質量符合要求，受試製劑確實超生物利用度。結果的評價應結合研究目的出發，進行生物等效性評價的目的提供兩製劑可替換使用的依據；進行生物利用度研究，則主要分析獲得的相對生物利用度數值進一步指導確定新劑型的臨床使用劑量。

（五）BE研究報告內容為了滿足評價的需求，一份生物等效性研究臨床報告內容至少應包括以下內容：
（1）實驗目的；
（2）生物樣本分析方法的建立和考察的數據，提供必要的圖譜；
（3）詳細的實驗設計和操作方法，包括全部受試者的資料、樣本例數、參比製劑、給藥劑量、服藥方法和采樣時間安排；
（4）原始測定未知樣品濃度全部數據，每個受試者藥代參數和藥時曲線；
（5）采用的數據處理程序和統計分析方法以及詳細統計過程和結果；
（6）服藥後的臨床不良反應觀察結果，受試者中途退出和脫落記錄及原因；
（7）生物利用度或生物等效性結果分析以及討論；
（8）參考文獻。正文前應有簡短摘要；正文末，應注明實驗單位、研究負責人、參加實驗人員，並簽名蓋章，以示對研究結果負責。

五、複方製劑
對複方化學藥品製劑生物等效性研究，一般情況下某一成分的體內行為不能說明其他成分的體內行為，故原則上應證實每一個有效成分的生物等效性。試驗設計時應盡量兼顧各個成分的特點。

六、結語
生物利用度和生物等效性研究隻是作為一個驗證製劑質量的方法學手段。受試製劑能否達到預期的生物利用度，受試製劑是否能達到與原研製劑或其他已經過臨床試驗證明了安全與有效藥物的生物等效，都應該從最開始的處方篩選、生產工藝條件以及質量研究等方麵著手，盡可能分析原研製劑或參比製劑的有關文獻，以實現研究目的。

七、名詞解釋
介質效應:由於樣品中存在幹擾物質,對響應造成的直接或間接的影響。標準樣品(Standard Sample)：在生物介質中加入已知量分析物配製的樣品，用於建立標準曲線，計算質控樣品和未知樣品中分析物濃度。
質控樣品（Quality Control Sample）：質控樣品係將已知量的待測藥物加入到生物介質中配製的樣品，用於監測生物分析方法的效能和評價每一分析批中未知樣品分析結果的完整性和正確性。一般配製高、中、低三個濃度的質控樣品。
分析批（Analytical run/batch）：包括待測樣品、適當數目的標準樣品和質控樣品的完整係列。由於儀器性能的改善和自動進樣器的使用，一天內可以完成幾個分析批，一個分析批也可以持續幾天完成，但連續測量不宜超過3天。 高溶解度（Highly soluble）：若藥物的最大劑量能溶解在 250ml 或更少的pH1-7.5的水溶液中，此藥物可被認為是高溶解度的藥物。250 ml的量來源於標準的生物等效性研究中受試者用於服藥的一杯水的量。
高滲透性（Highly permeable）：滲透性的分類標準以藥物在人體內的吸收程度（吸收劑量的分數，而不是係統生物利用度）為間接依據，以測定通透人體腸壁膜的量為直接依據。也可以選用能充分描述人體內的吸收程度（如體外上皮組織細胞培養法）的非人體係統。若沒有資料證明藥物在胃腸道內是不穩定的，以質量平衡測定法為依據，同靜脈注射給藥相比較為依據，當藥物的吸收程度達到90%時，此藥物可被認為是高滲透性的。
快速溶出（Rapidly dissolving）:利用規定的第一法裝置 100rpm(或二法裝置50rpm)，使用900 ml或少於900 ml的下列每種介質測定溶出度：（1）0.1mol/L HCl或符合藥典規定的無酶人工胃液；（2）pH 4.5的緩衝液；（3）pH 6.8的緩衝液或符合藥典規定的無酶人工腸液。在上述條件下，若一個口服製劑在30分鍾內其標示量的85%以上完全溶出，則此藥物被認為是快速溶出的。
高變異性藥物（Highly variable drug）：當某一藥物的個體內變異係數（以AUC或Cmax計算的個體內變異係數）大於或等於30%時，稱之為高變異藥物。這種變異的增加使得對樣本例數可能要求增加。

八、參考文獻（略）