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攻克乙肝不是夢，基因編輯靶向“剪切”乙肝病毒

2015-07-21
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7月28日是一年“世界肝炎日”，肝炎是肝髒的炎症，最常見的原因是病毒感染。病毒性肝炎分為甲、乙、丙、丁和戊型，雖然病毒種類不同，但都足以對人構成嚴重危害，其中乙型和丙型肝炎可以導致肝硬化和肝癌的發生，給全球帶來嚴重的疾病負擔。

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬於嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。據世界衛生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒（HBV）感染，大約3.5億至4億人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亞洲和非洲發病率尤其高。我國的乙肝病毒感染率約60%-70%；乙肝表麵抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。

基因編輯技術助力剪切乙型肝炎病毒

根據6月2日發表在Scientific Reports上的研究結果，該研究小組靶向切割了乙肝病毒（HBV）共價閉合環狀DNA（cccDNA）的一些特異位點。在一項新研究中，麻省理工學院的研究人員利用CRISPR/Cas9 係統，對受到感染的哺乳動物肝細胞進行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。

HBV共價閉合環狀DNA是乙肝複發的“元凶”

乙肝患者麵臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風險。盡管現有的抗病毒藥物可以控製乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝髒中的HBV會重新活化。這是因為cccDNA “匿藏”在細胞核中。

HBV的基因組（rcDNA）進入到細胞核後，rcDNA在病毒蛋白和宿主細胞因子的幫助下修複成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核後，在胞質中形成εpgRNA，並與病毒的聚合酶P蛋白共價結合，誘發核衣殼化。

與多數其他的病毒DNA的機製不同，HBV cccDNA通過pgRNA的反轉錄進行複製，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在於肝細胞內，且其半衰期很長（33～100天），細胞核內的最長壽命可達14年。隻要還存在於肝細胞中，cccDNA乙肝病毒的複製就不會停止，並與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細胞，而這是導致乙肝複發的根本原因。

因此，盡管每個肝細胞內隻有約5～50個cccDNA拷貝，但是隻要這些cccDNA池穩定，就可以使得病毒的持續感染延續，因而清除肝細胞內的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

CRISPR/Cas技術——基因編輯的“神器”

CRISPR/Cas技術是源於細菌及古細菌中的一種後天免疫係統，它可利用靶位點特異性的RNA指導Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。

其中的一個關鍵因子就是Cas酶，能用於切斷靶標DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補結合靶標。

隨著以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術靶標特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一係列與人類健康和疾病相關的基因治療的應用領域展現出極大的應用前景。

CRISPR/Cas9——靶向切斷慢性HBV感染

論文的主要作者之一Vyas Ramanan說：“我們為未來利用CRISPR/Cas9來靶向切斷慢性HBV感染提供了強有力的理論依據。”Ramanan和同事們設計了24條單鏈向導RNAs（sgRNAs）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點。



經過初篩測試後，研究小組將三個最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然後將它們轉導到了整合HBV的人類肝細胞內。Ramanan說：“對包含整合基因組病毒DNA的穩定轉染細胞係展開實驗，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達和複製均顯著減少。“進一步地在從頭感染模型中我們開展研究，在第9天我們看到這些病毒參數同樣大幅度降低。”

現在，Ramanan計劃在人類肝嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達人類功能性的治愈。他表示，盡管還有很多的工作要做，但其認為這是一個有趣的開始。
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