大腸杆菌表達係統與蛋白表達純化

hjc黄金城科研人員建立了成熟的大腸杆菌表達及純化服務平台，提供包括各種重組蛋白以及其複合物在大腸杆菌中的表達與純化服務。

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服務項目：

1. 重組質粒構建；

2. 重組表達測試；

3. 可溶性表達條件測試；

4. 小規模蛋白表達和純化（2L培養基培養產物）；

5. 大規模蛋白表達和純化（10L以上）。 

大腸杆菌表達係統遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養周期短，抗汙染能力強等特點, 是分子生物學研究和生物技術產業化發展進程中的重要工具。因此熟練掌握並運用大腸杆菌表達係統的基本原理和常規操作是對每一個研究者來說是非常必要的。

1.1大腸杆菌表達係統的選擇與構建

1.1.1表達載體的選擇

根據啟動子的不同這些載體大致可以分為熱誘導啟動子，如λPL，cspA 等和另外一類就是廣泛使用的IPTG誘導的啟動子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根據表達蛋白質的類型可分為單純表達載體和融合表達載體。融合表達是在目標蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進蛋白的正確折疊，實現目的蛋白的快速親和純化，或者實現目標蛋白的表達定位。常用的用於親和純化融合標簽包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多數是連續的六個His 融合於目標蛋白的N端或C端，通過His 與金屬離子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而實現親和純化，其中Ni2+是目前使用最廣泛的。His 標簽具有較小的分子量，融合於目標蛋白的N端和C端不影響目標蛋白的活性，因此純化過程中大多不需要去除。目前常使用的表達載體主要是由Novagen 提供的pET 係列和 Qiagen 公司提供的pQE 係列。

除了His 標簽外，還原性穀胱甘肽S-轉移酶是另一種實驗室常用的融合標簽。它可以通過還原性穀胱甘肽瓊脂糖親和層析而快速純化。此外，與His 相比，GST 很多時候能夠促進目標蛋白的正確折疊，提高目標蛋白表達的可溶性，因此，對於那些用his 標簽表達易形成包涵體的蛋白，可以嚐試用GST融合表達來改進。當然，GST 具有較大的分子量（26kDa），可能對目的蛋白的活性有影響，因此很多時候切除GST是必須的。目前，GST融合表達係統主要是由GE Healthcare（原Amersham）提供。

1.1.2宿主菌的選擇
重組質粒的構建一般選擇遺傳穩定，轉化效率高，質粒產量高的菌株作為受體菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等recA–和endA–型細胞。作為表達宿主菌必須具備幾個基本特點：遺傳穩定，生長速度快，表達蛋白穩定。具體操作過程中，根據所使用的表達載體的特點，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達宿主菌。以下是實驗室常用的幾種表達宿主：
BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主對外源蛋白的降解。是經典的使用最廣泛的表達受體。適用於Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作為啟動子的載體。
BL21（DE3）： DE3噬菌體溶源於BL21 形成的帶有染色體T7 RNA 聚合酶基因大腸杆菌。IPTG 誘導的lacΜV5 啟動子控製T7 RNA 聚合酶基因表達T7 RNA 聚合酶，進而控製T7 表達係統表達目的蛋白。
BL21（DE3）衍生係列：在經典的T7表達係統BL21（DE3）的基礎上，Novagen 公司開發了一些特殊的表達宿主細胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株帶有 trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
Rosetta? 係列：是經過修飾，專用於帶有大腸杆菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。經提高稀有tRNA 水平，可以提高一些真核基因表達效率（更多信息可參考相應公司的資料）。
BL21-Codon Plus係列：包括BL21-CodonPlus? （DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs?-RIL，BL21-CodonPlμs?（DE3）-RIL, BL21-CodonPlμs?-RP，BL21- CodonPlus? （DE3）-RP等。這些受體菌添加了大腸杆菌中編碼精氨酸（R），亮氨酸（L），異亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密碼子的tRNA 基因，更多用於表達一些真核生物的基因。其中RIL係列常用於AT 含量高的基因，而RP係列主要用於GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene 公司資料）。
M15/SG13009：自身表達T5 RNA polymerase，主要用於pQE係列載體的表達。
另一個需要考慮的是大腸杆菌的密碼子及其偏愛性。

表1 大腸杆菌密碼子使用頻率統計

1.2表達條件的建立

為了方便後續的純化操作, 保持目標蛋白的活性,提高蛋白的得率，我們在進行蛋白的大量製備之前應該首先確定目標蛋白的最佳表達條件。首先，保證表達蛋白穩定，盡量避免蛋白酶的降解，我們可以通過使用一些蛋白酶缺陷性的表達宿主，其次在表達的過程中可以在培養體係中添加一些蛋白酶抑製劑等來解決。與實現外源蛋白的穩定表達相比，更多時候保證目標蛋白的可溶性表達，是建立表達條件的主要工作。很多外源基因在大腸杆菌表達時很容易形成不可容的包涵體，其原因可能有：表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體；蛋白合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對；過多蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。目前對包涵體的形成和複性過程中發生聚集的機製尚不清楚, 但已經報道了很多用於優化表達以增加目標蛋白可溶性的方法。

1.2.1確定表達狀況
轉化構建好的質粒至表達宿主感受細胞，挑取單克隆子至5ml 含有相應抗性的LB 培養基中，37℃，200 rpm，培養至OD600=0.5左右，加入IPTG至終濃度0.2mM，轉移至28℃，200 rpm 繼續誘導培養，可以在2h，4h，6h分別取樣以分析表達狀況。
將取出的1ml 菌液12000 rpm 離心1min，收集菌體，加入1ml PBS 緩衝液重懸沉澱，同樣離心1min。再加入300～500ml PBS重懸細胞。
超聲破碎細胞（具體見操作細胞破碎）
將破碎液體4℃，12000 rpm 離心10min，分離上清和沉澱。
SDS-PAGE 分析上清和沉澱的蛋白分布（具體操作參考SDS-PAGE）。
若在上清中有明顯的目的蛋白的條帶，即可以放大培養進而純化目標蛋白。若目標蛋白的表達主要分布於沉澱，則可以嚐試一下幾種方法來改善表達。
改變表達載體下手，像GST，NΜS，MBP, TrxA等融合標簽能夠提高很多蛋白在大腸杆菌中表達的可溶性，此外一些分泌標簽如ompA,Pet-22b上的pelB也能夠將目標蛋白運輸至細胞的周質空間，從而提高目標蛋白的可溶性。
降低表達速度，可采取低溫誘導，如15℃誘導過夜，或者采用弱啟動子表達載體。
嚐試一些特殊設計的表達宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 雙突變適合帶thioredoxin redμctase的融合表達載體，幫助形成更多的二硫鍵。
對於一些蛋白可能無法實現可溶性表達，這時候溶解包涵體後再純化是唯一的解決辦法。

1.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
大腸杆菌表達純化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。可以用來檢測蛋白的表達情況(表達量，表達分布等)，用來分析純化的目的蛋白的純度。本小節列出SDS-PAGE 操作中一些試劑的配置及其基本的操作過程。

1.2.2.1主要試劑的配置
（1）30%丙烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亞甲雙丙烯酰胺溶於100ml熱水中，驗證其pH值不大於7.0。置棕色瓶中，4℃保存。
丙烯酰胺具有很強的神經毒性並可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應戴手套和麵具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。建議實驗室劃出專門的台麵，設置單獨的配置器皿進行SDS-PAGE 的相關實驗。
（2）1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液。
（3）10% SDS溶液：SDS 10.0g 加入ddH2O ToTo100。
（4）10%過硫酸銨：新鮮配製。
（5）TEMED溶液：4℃保存。
（6）1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液。
（7）2×樣品溶解液：2%SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩衝液。
（8）5×Tris-甘氨酸電極緩衝液： 15.1g Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建議每次電泳用新稀釋的緩衝液）。
（9）考馬斯亮藍R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考馬斯亮藍R，攪拌溶解。
（10）脫色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建議不要使用甲醇）。

1.2.2.2主要操作步驟

1、凝膠製備
（1）安裝洗滌幹淨的玻璃板、板條，並將玻璃板固定在電泳槽中。
（2）配製10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩餘的板寬比梳子長度多1cm。小心在膠上覆蓋一薄層異丙醇或水。
（3）在分離膠聚合的過程（可置於37℃，約10min）中，配製5%的積層膠（參考表格3）。
（4）分離膠聚合完全後，倒去異丙醇或水，用濾紙吸幹膠麵上的殘餘。
（5）灌注積層膠，立即插入幹淨的梳子，避免產生氣泡。
（6）積層膠聚合完全後，小心拔出梳子，撥去封膠用的塑料條，固定於電泳槽。
（7）在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩衝液。
2、樣品的製備
在蛋白溶液中加入等體積的2×樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱5min，冷卻後即可上樣。
3、上樣
用微量移液器上樣，每加入一種樣品，上樣量根據根據具體的樣品濃度確定，未知濃度一般用10微升。
4、電泳
對於一塊膠，在濃縮膠中電流設置在15～20mA, 當染料進入分離膠後可設置電壓至電流約為25～30mA，繼續電泳直至染料到達離凝膠底部1cm處。
5、後處理
（1）染色：加入染色液（用量同上），室溫染色30min～1h。
Tip：染色前可將染色液在微波爐裏加熱至沸，然後搖床震蕩染色約10min即可。
（2）脫色：將染色後的膠塊用水洗滌三次去除表麵染料，然後加入脫色液脫色，其間更換脫色液3～4次至條帶清晰。
Tip：10min快速脫色:將脫色液置於微波爐煮沸，更換三次脫色液。

表2. 配製SDS-PAGE 不同濃度分離膠的配置

1.3細胞破碎獲取蛋白質

大腸杆菌細胞破碎有很多方法，譬如反複凍融法，滲透衝擊，超聲破碎，壓力破碎等。其中超聲破碎和壓力破碎破碎是我室常用方法。

1.3.1超聲破碎
在建立表達條件過程中，小量製備樣品可用小型超聲細胞粉碎儀。離心1.0～1.5ml 誘導後的菌液收集菌體，然後視菌體的量加入300～500μl的緩衝液重懸細胞，然後置於冰上超聲破碎。因很多實驗室有自己的小型超聲粉碎器,各個操作不盡相同，具體操作參考儀器說明書。常規操作步驟如下（以100ml 培養液為例）：
（1）100 ml 誘導後的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體。
（2）加入預冷的緩衝液50ml，重懸細胞洗滌菌體一次，12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體；常規的操作所使用的緩衝液多為PBS 或者 Tris-NaCl，針對不同的載體和純化方法，選擇相應的緩衝液。對於一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整個操作過程中加入一些蛋白酶抑製劑。
（3）向沉澱中加入15ml的緩衝液同上（若菌體太濃，可加倍），充分懸浮，將菌懸液裝在一個玻璃小燒杯中，置於冰水混合物中。
（4）破碎：將用緩衝液洗滌過的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強度為5～6，頻率為60～70％。
（5）分離上清和沉澱：12000 rpm，4℃離心20min，分離上清和沉澱。
（6）SDSPAGE 分析蛋白表達情況。
（7）準備純化蛋白。

超聲破碎注意事項與一些小的改進：
（1）破碎完全的判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全後變的透明、清澈。
（2）如果超聲時出現黑色沉澱，說明超聲功率太強。
（3）超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。
（4）盡量防止泡沫的產生。
（5）大量破碎時將菌液置於一玻璃器皿中，破碎時放在冰水混合物中，以增加散熱，減小對蛋白的破壞作用。
（6）破碎前的預處理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）處理破環細胞壁（10min，30℃），增加細胞的通透性。

1.3.2壓力破碎
高壓破碎是大量的破碎提取細胞內成份的首先方法，相對於超聲破碎，它具有過程溫和，操作迅速等優點，具體使用需要根據具體的儀器使用說明。

FRENCH? PRESS 細胞破碎儀標準操作規程
（1）使用前將高壓腔、底座、活塞杆在4℃冰箱中預冷30min。
（2）將三腳固定器置於水平桌麵上，將高壓腔正放在固定器器上；在活塞杆的O型環、底座的O型環和針形閥的O型環上均勻塗上少量凡士林。
（3） 把活塞杆正向插入高壓腔至最大加樣線，將整個腔體連同活塞杆一起倒轉固定在固定器上。
（4） 將菌液倒入腔體，最大處理量為35ml，最小為5ml。視樣品體積，大致估計並調整活塞杆的位置。
（5）將針形閥和樣品噴射管裝配於底座上，針形閥擰到輕輕不能擰動為止，並向反方向稍微鬆動，保證閥門處於開啟狀態（注意：務必不能用力擰緊，否則會降低其密封性）。把底座倒扣於腔體上，向上調整活塞杆的位置，直至腔內空氣完全排出，流出一滴樣品為止，輕輕旋緊針形閥。
（6）雙手托起整個高壓腔組件，翻轉至正向位置，將其置於升降台上（事先要確保操作台足夠的低，以容的下整個組件），向後推動底座，使底座固定於三個位置校準針之間，並調整腔體使針形閥朝向正麵。將固定夾固定於支持杆上，擰緊固定夾上的兩個螺絲以固定腔體。將活塞杆上的手柄轉至與固定夾垂直的方向。
（7） 打開電源，將檔位手柄轉至HIGH檔，順時針旋轉壓力控製閥至50psi，升降台開始上升，當活塞杆接觸上頂台後，繼續順時針旋轉壓力控製閥，直至壓力達到需要的壓力（大腸杆菌的破碎壓力一半設定為12000psi，芽孢杆菌設定為2000psi）。
（7）取一冰預冷的離心管（或者將離心管至於冰中）置於樣品噴射管出口處，輕輕逆時針轉動針形閥，小心控製樣品的流出速度，根據破碎程度決定流速（建議在噴射管出口處接一個1cm長的透明的塑料管如輸液管，通過觀察塑料管流出樣品的透明度來判斷破碎是否完全）。當活塞杆上的安全指示線（Stop Line）降至腔體上表麵時，迅速關緊針形閥（不要過緊），旋轉檔位手柄至DOWN位置。待升降台完全下降後，繼續降低壓力至零，關閉電源。
（8）鬆開固定夾，取出高壓腔，重新倒置於三腳固定器上，取出底座。將各部分拆開，徹底清洗。底座及噴射管的內壁要重點衝洗，塗有凡士林處要用洗潔精徹底洗淨。

【注意事項】
（1）儀器最大承受壓力為4000psi（指示針2500）。
（2）各O形環處（包括樣高壓腔，底座，活塞杆和針形閥）一定要塗凡士林潤滑，以降低磨損，防止損傷。
（3）壓力的升高或降低速度要控製在一定範圍內。升高壓力前務必保證整個組件固定於升降台上,任何的鬆動可能導致事故。
（4）活塞杆的手柄要與固定夾垂直，否則會發生危險。
（5）嚴禁將出樣閥過分擰緊，否則會損壞內部撞針，以不流出液體為準。
（6）嚴禁使活塞杆下至安全線以下，否則會導致活塞杆與底座損壞。
（7）使用完畢要將壓力控製閥轉至壓力為零。
（8）各部件清洗要徹底，否則底座小孔容易堵死，活塞杆上殘留的菌體會在未洗淨的凡士林上滋生。
（9）長期不用應保存在幹燥的環境中，必要時可塗凡士林防止生鏽。
（10）壓力腔的空氣一定要完全排出，否則當樣品完全排出時，造成活塞與壓力池底座直接接觸，造成損傷，由於壓力非常大，有可能導致活塞或壓力池底座變形，造成永久性損傷！
（11）在搬動裝好的樣品池時，一定要雙手，一手扶住住高壓腔，一手托住底座，防止底座脫落而造成事故。
（12）O型環若老化則及時更換。
（13）操作過程中禁止將液體濺入機箱內部。
（14）儀器使用過程中出現故障應及時與負責人聯係。

1.4目的蛋白的純化

1.4.1 His Tag 純化操作實例
本實驗室中所用的表達載體pET28a（+）中含有一個編碼多聚組氨酸的序列，即His-Tag，因此會獲得帶有His-Tag的重組目標蛋白。His-Tag可與金屬Ni2+離子結合，從而有利於目標蛋白的純化。加上了His-Tag的蛋白在非變性的條件下可用Ni2+親和層析柱純化。純化蛋白的原理是：當親和層析柱負載了Ni2+後，可以選擇性吸附暴露在蛋白表麵具有複雜結構的氨基酸殘基（特別是組氨酸殘基）。蛋白質中含有的組氨酸越多，與Ni2+結合的特異性就越高，則將其洗脫下來會需要更高的咪唑濃度。含有組氨酸標簽的目標蛋白與細胞中的總蛋白相比，具有更高的Ni2+結合特異性。為了得到具有較高純度的目標蛋白，必須找到一個合適咪唑濃度的洗脫液（結合緩衝液），在此濃度下非特異性的雜蛋白能從柱上洗脫下來，而與Ni2+特異性結合的目標蛋白不會被洗脫。最後用更高咪唑濃度的緩衝液（洗脫緩衝液）將目標蛋白洗脫下來，此時目標蛋白特異性的存在於該咪唑濃度的洗脫液中，從而得到純化了的目標蛋白質。

1.4.1.1 重組蛋白的誘導
（1）載體構建：本實驗采用pET-28a（+）表達載體，克隆受體菌為E.coli DH5α，表達宿主為E.coli BL21(DE3)。具體操作參考基因克隆與轉化部分。
（2）挑一個轉化重組質粒的單菌落接種於LB液體培養基中（含100μg/m卡那黴素和），於37℃過夜培養。
（3）取1ml過夜培養物，轉接於100ml含100μg/ml卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃培養1.5～2小時至對數生長期。
（4）在培養物中加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.2 mM，按照預先建立的最佳表達條件進行誘導表達。
（5）1200 rpm，離心2min，收集菌體。
（6）棄上清，向沉澱中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸緩衝液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH 7.0），充分懸浮洗滌菌體。
（7）12000 rpm，離心2min，收集菌體。
（8）向沉澱中加入15ml的starting buffer，重懸菌體。
（9）冰浴條件下超聲波處理3min，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強度為5～6，頻率為60～70％，處理時以不發生氣泡，不過熱為準，以菌液變清晰為終止標準。
（10）12000 rpm，4℃離心20min，將上清移到幹淨滅過菌的50ml離心管。

SDS-PAGE 分析蛋白的表達情況。若目的蛋白分布在上清中，繼續進行下麵的純化操作。

1.4.1.2 目標蛋白的體外純化
（1）灌製好Ni2+-NTA親和層析柱，用去離子水進行緩慢洗脫，避免在柱床中引入氣泡。
（2）用10倍柱床體積的starting buffer進行預平衡，上樣，將細胞破碎後的上清液注入Ni2+-NTA親和層析柱中。
（3）用10倍ml的starting buffer進行漂洗，收集濾過液。
（4）開始用5倍柱床體積的含20 mM咪唑的starting buffer進行洗脫，並對洗脫液進行收集。
（5）依次用5倍柱床體積的含40 mM，60 mM，80 mM，100 mM，200 mM，300 mM和500 mM咪唑的starting buffer進行洗脫，分別對洗脫液進行收集。
（6）通過SDS-PAGE檢測回收的效果，確定咪唑最合適洗脫濃度。
（7）從每管收集的濾出液取出10μl的樣品，加入10μl的2X SDS凝膠加樣緩衝液，搖勻。
（8）沸水浴處理3min。
（9）取出樣品，將10μl樣品全部上樣於適當濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。

【注意事項】
（1）樣品可貯存於4℃，以備在聚丙烯酰胺凝膠上加樣。
（2）用考馬斯亮藍或銀染液進行染色，檢測重組蛋白的純化程度，並找到咪唑最合適洗脫濃度，也就是純化蛋白含量最多的一管洗脫液所對應的濃度；並將該純化出來的蛋白質經過PD-10柱子以去掉溶液中的咪唑。　
（3）蛋白質被洗脫完成之後，要及時地清洗柱子，使柱子能重複使用。
（4）在下次對同一蛋白的純化過程中，即可根據膠圖所顯示的個洗脫液中蛋白濃度的情況來優化整個洗脫過程。

蛋白質溶液的去鹽處理（使用PD-10去鹽柱）
（1）用10ml的starting buffer平衡PD-10去鹽柱。
（2）上樣：往PD-10去鹽柱中加入2.5ml的蛋白質溶液。
（3）用10ml的starting buffer去洗PD-10去鹽柱，開始收集濾出液，每1ml收集一管。離心管應該先在冰上預冷。
（4）電泳檢測重組蛋白質的純化程度。
（5）具體方法和過程與上麵步驟一致。
（6）選擇合適的純化蛋白樣品，加入1倍體積的預冷甘油。接著將蛋白質樣品置於－80℃保存，以備使用。

【注意】PD-10去鹽柱可以多次反複使用，但是不能使柱子變幹，保存時應該用相應的緩衝液浸泡，並且置於4℃。

圖 1：PD-10去鹽柱除去鹽離子示意圖（載自Amersham Biosciences產品說明）

1.4.1.3 His-tag NOTE

（1）若His標簽蛋白沒有結合，請依次檢查：
可能原因1：樣品或者是結合緩衝液不正確。策略：檢測pH 及樣品和結合緩衝液的組成份。確保在溶液中鼇合劑或強還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。
可能原因2：組氨酸的標簽沒有完全的暴露。策略：在變性條件下(用4～8 M 脲，或4～6 M鹽酸胍)進行純化。
可能原因3：HIS標簽丟失。策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達，上遊構建，改變his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要時增加his個數(常用6～10個)；策略2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間；策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結合金屬離子。

（2）若沒有洗脫下來，請依次檢查：
可能原因1：洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上，結合力較強）。策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來找出最佳的洗脫條件。
可能原因2：降低PH的方法洗脫的，因為若PH低於3.5，會導致鎳離子脫落。策略：改變洗脫辦法，咪唑競爭性洗脫。
可能原因3：蛋白已沉澱在柱上。策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去汙劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4～8 M脲，或4～6 M 鹽酸胍)。
可能原因4：非特異性疏水或其他相互反應。策略：加非離子去汙劑到洗脫緩衝液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl的濃度。

（3）HIS標簽蛋白洗脫後雜帶較多，什麽原因? 如何優化?
高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由於很多天然的蛋白也會帶有HIS，所以經常會出現HIS標簽蛋白洗脫後有一些雜帶，可能的原因和優化的方法如下：
可能原因1：蛋白酶部分降解了標簽蛋白。策略：請添加蛋白酶抑製劑，（慎用EDTA）。
可能原因2：雜質對鎳離子有更高的親和性。策略1：咪唑濃度必須優化，以確保高純度（宿主細胞蛋白質的低結合）和高產率（組氨酸標記的目標蛋白質的強結合）之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優的咪唑結合和清洗濃度；在樣品中加入與結合緩衝液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20個或更多的柱床體積），可能分離出有相似結合強度的蛋白。策略2：篩選最適合的緩衝液條件，NaCl濃度，PH的範圍都需要進行篩選，以便決定最適的結合和洗脫條件。對於單一目標蛋白在進行緩衝液篩選時，將緩衝液、鹽、甘油和還原劑設計成幾個不同的混合配方。
可能原因3：雜質和標簽蛋白結合在一起。策略：在超聲破碎細胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子
可能原因4：洗滌不充分。策略：增加洗滌的次數,使洗滌充分。

1.4.1.4 NTA樹脂的再生
NTA樹脂在使用若幹次數（3～5次）後，結合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質的結合效率。注意：NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流幹所有溶液，估計出NTA的樹脂體積，按下列次序將再生試劑加到層析柱裏，在等上一再生溶液流幹後，再加下一再生溶解。用戶需要自行準備25%，50%，75%，100%（v/v）乙醇和去離子水。

NTA再生步驟：
（1）從層析柱下端流幹所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的0.2M Acetic Acid/6M gμanidine HCl 洗。
（2）用2倍體積的去離子水洗。
（3）用3倍體積的2% SDS洗。
（4）用1倍體積的25%乙醇洗。
（5）用1倍體積的50%乙醇洗。
（6）用1倍體積的75%乙醇洗。
（7）用5倍體積的100%乙醇洗。
（8）用1倍體積的75%乙醇洗。
（9）用1倍體積的50%乙醇洗。
（10）用1倍體積的25%乙醇洗。
（11）用1倍體積的去離子水洗。
（12）用5倍體積的0.1M EDTA pH8.0洗。
（13）用3倍體積的去離子水洗。
（14）如果立即使用，用5倍體積的100mM NiSO4.6H2O洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0 buffer或GμNTA-0 buffer）洗。
（15）如果想長期儲存，加入1倍體積的20%乙醇，4度保存，使用前需要執行步驟14。

1.4.2 GST 親和標簽的純化
穀胱甘肽S- 轉移酶（GST）是繼組氨酸之後的第二個應用最多的重組蛋白標記。GST 融合於目標蛋白的N端，可以通過穀胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。由於GST 對底物還原性穀胱甘肽的親和力是亞摩爾級的，因此穀胱甘肽固化於瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST 及其融合蛋白的純化效率很高。用1ml 的樹脂純化1L 的大腸杆菌培養物可得到的目的蛋白產率為0.1～6.0 mg。
GST 親和純化融合蛋白主要包括結合，洗滌，洗脫三個步驟，全過程隻需要一到兩種緩衝液，可以大量純化，也可以小量的實現快速純化。非常適合實驗室小量製備大腸杆菌重組蛋白。下麵以克隆到表達載體pGEX-6p-1上的GFP 表達純化為例，介紹一種小量快速的純化方法，供大家參考。蛋白的誘導與樣品的製備方法基本同上。

1.4.2.1 GST 親和標簽純化的使用
（1）從4℃冷櫃中取出Glμtathione Sepharose 4B（本產品購置GE公司，儲存於20%乙醇，樹脂的量和20%乙醇1：1），輕柔、充分翻轉搖勻樹脂懸濁液。
（2）用寬嘴吸頭吸取1ml 的脂漿，加入到裝有40ml 的PBS(整個操作過程所有的PB均需預冷) V型離心管中，輕柔顛倒數次，洗滌除去殘留的20%乙醇，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出PBS。
（3）將破碎後的上清加入平衡上一步驟中的樹脂中，輕輕混勻，4℃振蕩溫育，500 rpm ，1h，期間不斷混勻，防止樹脂沉澱，保GST-GFP 充分結合於樹脂上。
（4）2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。
（5）向沉澱中加入約40ml 的PBS，輕柔混勻，振蕩溫育10 min，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。
（6）重複步驟（5）一次，然後向沉澱中加入5ml 的PBS 懸浮樹脂，並將懸浮液轉移到一個10ml 的塑料層析柱，並打開閥門放掉PBS。
（7）洗脫收集目的蛋白。根據實驗需要不同有兩種方法來收集目的蛋白。
方法一：是不切除GST-tag，可以向（6）中的樹脂中加入1～2ml 的洗脫緩衝液（50 mM Tris-HCl，10 mM 還原性穀胱甘肽（GSH），pH 8.0），輕輕混勻然後4℃溫育10min，收集流出液，即為GST-GFP的純化產物。
方法二：是純化不含GST-tag 的蛋白，按照說明書將蛋白酶PreScission Protease（GE公司）用PBS 稀釋到到1ml，加入到（6）中的樹脂中，輕輕混勻然後4℃溫育12h，收集流出液，即為GFP的純化產物。
（8）SDS-PAGE 分析純化的蛋白。可以對操作過程中的每一步取樣進行SDS-PAGE分析。

1.4.2.2 Glμtathione Sepharose 4B 再生
GST?Bind樹脂可以重複使用數次而無需再生。但隨著非特異性結合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往會造成流速和結合載量都下降。為了去除結合在樹脂上的蛋白，可以用10倍體積的50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0洗樹脂，接著用10倍體積的100mM醋酸鈉pH4.5，0.5M NaCl再洗一次。其它可以選用做去除汙染蛋白的緩衝液還包括：6M尿素，6M鹽酸胍或低極性溶劑，如50～70%乙醇或50%乙二醇。任何上述處理後應該立即用10倍柱體積1X GST Bind/Wash buffer平衡。樹脂可以在4℃下，20%乙醇/80%水中長時間存放。

1.4.2.3 GST使用過程中可能的問題與對策
（1）目標蛋白結合效率低
結合條件不對：仔細核對各種溶液、緩衝液的成分和pH。低於pH6.5或高於pH8時，融合蛋白與GST?Bind樹脂會結合不充分。確保樹脂在與細胞裂解液結合前經過pH6.5～8.0緩衝液（如1X GST Bind/Wash buffer，PBS）的平衡細胞裂解前加入DTT會顯著改善某些GST融合蛋白與GSTBind樹脂的結合
GST融合蛋白被超聲打斷降解：過度超聲會破壞帶標簽的蛋白而減少其與樹脂的結合。采用溫和的超聲條件或改用其它的破碎方法。
蛋白的折疊問題：GST 標簽不能夠正確的折疊難以結合GSH的底物。

（2）蛋白難以洗脫
洗脫體積太少：有時需要使用更多的緩衝液洗脫目的蛋白。
洗脫緩衝液不新鮮： 10XGST洗脫緩衝液－20℃下可以穩定存放6個月，最多耐受5次凍融。每次在臨純化前新鮮配製1X洗脫緩衝液
洗脫緩衝液中穀胱甘肽濃度太低：GST?Bind樹脂的還原型穀胱甘肽濃度達到10mM就夠了。但是洗脫時需要的還原型穀胱甘肽的濃度需要達到75mM。

（3）純化的蛋白雜質很多
表達的蛋白不完整：再遇到一些稀有密碼子或者特殊的RNA的二級結構時，可能使得目標蛋白截短表達，可采用一些特殊的表達宿主，如Rosetta係列。
洗滌體積不夠：增加洗脫量。
洗脫條件：可已在洗脫緩衝液中加入一定量的非離子去汙劑，如0.1%的Triton-100 或NP-40等。也可以嚐試提高洗脫時NaCl 的濃度，以降低非特一性的結合。
操作過程中目標蛋白降解：控製操作條件，比如嚴格4℃操作，緩衝液中加入蛋白酶抑製劑，
超聲處理過度：減少超聲，避免發泡導致蛋白變性。過度超聲還會增加宿主內源蛋白與GST融合目的蛋白共純化
共價共純化：膠上有些多出來的條帶是共純化的促進蛋白正確折疊的分子伴侶，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再進行一次純化可以改善。

1.4.3 MBP 親和標簽的純化

原理：pMAL?係統是一種高效的蛋白融合表達及純化係統。pMAL載體含有編碼麥芽糖結合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大腸杆菌malE基因，其下遊的多克隆位點便於目的基因插入，表達N端帶有MBP的融合蛋白。通過“tac”強啟動子和malE翻譯起始信號使克隆基因獲得高效表達，並進一步利用MBP對麥芽糖的親和性達到用Amylose柱對融合蛋白的一步親和純化。
此係統的pMAL載體含有LacZα基因，目的基因的插入導致其失活，通過X-gal平板可進行藍白斑篩選。 pMAL載體都含有一段編碼蛋白酶識別位點的序列，融合蛋白純化後，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。
pMALTM-c2 係列載體缺失malE 信號序列，導致融合蛋白在細胞質中表達。pMAL-p2係列載體含有malE 信號序列，它可引導融合蛋白穿過胞質膜，進入周質。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識別位點的序列，融合蛋白純化後，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。

Amylose 樹脂預裝柱是一親和基質，用來分離與麥芽糖結合蛋白融合的目的蛋白。
結合容量：每毫升柱床體積可結合3.0 mg MBP-Paramyosin 融合蛋白。
貯存：本品預膨脹在20%的乙醇中，4°C貯存。
過柱緩衝液：20 mM Tris-HCl， pH7.4，200 mM NaCl，1 mM EDTA。
添加劑：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。
洗脫緩衝液：過柱緩衝液+10 mM 麥芽糖

實驗步驟：
（1）重組質粒的構建，轉化，融合蛋白的誘導表達和細胞破碎同上。
（2）融合蛋白的親和純化：
預裝柱用8～12倍柱床體積的雙蒸水衝洗；
預裝柱用9倍柱床體積過柱緩衝液平：
將上述實驗步驟三的上清液加入到柱床內，控製流速0.5～1 ml/min（建議每次上樣2～4ml）。
用12倍柱床體積的過柱緩衝液淋洗未結合蛋白，每次用6ml，共4次。
用4倍柱床體積的洗脫緩衝液洗脫與Amylose樹脂結合的MBP融合蛋白，控製流速約0.5～1 ml/min。收集3～5管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一個柱床體積內將被洗脫下來，可以通過波長為280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍蛋白檢測法進行檢測。
SDS-PAGE檢測洗脫樣品*。
再生。每次純化蛋白完畢後，需要及時對Amylose樹脂進行再生。 Amylose樹脂可以采用下述清洗步驟進行再生


【注意事項】
（1）每次使用時，請先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進入到預裝柱內。
（2）在使用本預裝柱時，請使用經過脫氣後的緩衝液，以避免產生氣泡。
（3）預裝柱在每次使用完畢後，在柱床上方加入2～4 ml 緩衝液或水，蓋上頂端的帽子後，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置於4℃貯存。
（4）長期貯存時應貯存在含0.02％疊氮鈉的緩衝液中或20％乙醇中，以避免染菌。

【pMAL係統的優勢】
（1）75%的蛋白可獲得高效表達，蛋白產量可達100 mg/L
（2）與其他幾種常用表達係統研究比較，與MBP融合表達更能提高E. coli表達蛋白的可溶性。
（3）采用麥芽糖溫和洗脫：無去汙劑或變性劑對蛋白活性的影響。
（4）可在細胞質或周質中表達（pMAL-p2X載體）：周質表達可提高二硫鍵的形成，促進蛋白折疊的形成。

1.5目的蛋白的後處理

8.5.1目的蛋白的濃縮
蛋白的濃縮液是蛋白純化過程中常用的操作，常用的方法有：
（1）透析袋濃縮法
利用透析袋濃縮蛋白質溶液是應用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無透析袋可用玻璃紙代替），結紮，把高分子（6 000～12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30～40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過後，可放入溫箱中烘幹或自然幹燥後，仍可再用。

（2）冷凍幹燥濃縮法
這是濃縮蛋白質的一種較好的辦法，它既使蛋白質不易變性，又保持蛋白質中固有的成分。它是在冰凍狀態下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然後移置幹燥器內（幹燥器內裝有幹燥劑，如NaOH、CaCl2和矽膠等）。密閉，迅速抽空，並維持在抽空狀態。數小時後即可獲得含有蛋白的幹燥粉末。幹燥後的蛋白質保存方便，應用時可配成任意濃度使用。也可采用凍幹機進行冷凍幹燥。

（3）超濾膜濃縮法
此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出，而蛋白質存留於膜上達到濃縮目的。有兩種方法進行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內，在不斷攪拌之下過濾。另一種是將蛋白液裝入透析袋內置於真空幹燥器的通風口上，負壓抽氣，而使袋內液體滲出。

（4）凝膠濃縮法
選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據幹膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數而稱取所需的幹膠量。放入冰箱內，凝膠粒子吸水後，通過離心除去。

1.5.2蛋白質的定量

定量作為生物實驗室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在生物學相關的研究中，無論是對蛋白質表達譜的定量比較還是蛋白質理化性質的分析，都建立在準確的定量這一基礎之上。蛋白質的快速定量方法主要依靠蛋白質本身的發色基團，或其與其它顯色劑反應產生的紫外吸收來進行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。

（1）直接紫外吸收法
由於蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個蛋白質都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長範圍內，蛋白質溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關係，我們可以對其進行定量。紫外吸收法測定蛋白質含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不幹擾測定。因此，已在蛋白質和酶的生化製備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補的缺陷。首先，對於測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差，故該法適於測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現較大幹擾。例如，在製備酶的過程中，層析柱的流出液中有時混雜有核酸，應予以校正。

（2）Bradford法
目前，實驗室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進行測定蛋白質含量。其原理為，蛋白質與染料考馬斯亮藍G-250結合，使得染料最大吸收峰從465nm變為595nm，在一定的線性範圍內，反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。測定時一般用牛血清白蛋白作為標準品。該法測定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍G-250反應顯色的去汙劑，比如Triton、NP-400、吐溫等。與具體操作可參考相關試劑盒說明書。

（3）Lorry法
其原理是蛋白質與堿性銅溶液中的Cu2+絡和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應，產生藍色，在一定濃度範圍內，其顏色的深淺與蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由於各種蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質作標準。具體操作可參考相關試劑盒說明書。

一般而言，紫外吸收法適合於與色譜柱聯用，達到實時監控，然而較不準確。Bradford法適合於大規模測定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去汙劑，對樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去汙劑，相對的操作就比較複雜。我們需要在試驗中按照要求選用不同的定量方法。目前後兩種常用的定量方法都有相關的試劑盒采用。

1.5.3蛋白的保存

純化的蛋白往往需要在一定的保存條件，以保證目標蛋白的穩定，避免活性喪失。

蛋白溶液的保存原則：
（1）緩衝液pH 避免接近蛋白的等電點；
（2）根據每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反複凍融；
（3）加入穩定劑如甘油，DTT, TritonX-100等。具體操作根據實驗需要和蛋白特性，多數蛋白都可以加入終濃度為50%的甘油後－80℃保存。