急性毒性試驗/檢測/評價

急性毒性試驗/重複給藥篩選試驗

急性毒性評價是體內安全性評價的基本類型之一，藥品注冊往往需要進行急性毒性評價。急性毒性試驗的數據在安全性評價中有著特殊的作用，可以在最初的毒性描述中確定MTD或MFD。在這些試驗中得到的數據可以為安全藥理學試驗以及重複給藥毒性試驗的劑量選擇提供依據。急性毒性試驗還可用於早期候選藥物的篩選，或者與簡單的重複給藥毒性試驗同時運用。應注意的是，隻有獲得了基於暴露途徑和臨床適應症的生物利用度和係統暴露的資料，才能為急性毒性研究提供有價值的信息。

（一）急性毒性（重複給藥篩選試驗）
急性毒性試驗可以有多種形式，但其主要目的是相同的，即測試所篩選的藥物在臨床劑量的若幹倍數下能被耐受。篩選試驗的好處在於可以在同一試驗中同時比較幾個候選藥物。耐受性指標[如體重和（或）飼料消耗的變化以及異常的臨床症狀]可以為確定哪種候選藥物提供更好的參考依據。此時動物品種的選擇一般不要求是全部動物品種，但至少評價一種齧齒類動物。對於預定期每天服用的藥物，在5~7天的暴露周期內對重複給藥進行評價也是合理的。這有助於初步評價臨床病理學終點的潛在改變，並且對於其他毒性試驗項目的劑量選擇也是有用的，但它不能替代急性毒性試驗進行注冊申請提交。

（二）急性毒性試驗的基本設計包括每組動物數量相對較少的數個劑量組。對於齧齒類動物試驗，每個劑量組每個性別5隻動物是足夠的。第二種動物品種一般使用2~3隻動物。應設溶媒對照組至少3個供試品劑量組。劑量組也可以再增加，尤其是在進行急性毒性試驗時對其毒理學概況知之甚少的情況下。在單次給予供試品後，體重、飼料消耗量和臨床觀察室獲悉毒理學作用的關鍵性數據。在給藥指定的天數後對存活動物給予安樂死（通常是給藥後第14天）。大體解剖旨在對組織和器官的肉眼可見病變進行評估。但在大多數情況下對這些組織不再做進一步的組織病理學檢查。毒性評價一般僅限於觀察明顯的毒性反應，如體重變化、飼料消耗量減少和（或）死亡、病態和供試品的藥理學左右等臨床觀察。急性毒性試驗資料可為隨後的重複給藥毒性試驗的劑量設計提供參考。

服務項目：

考察受試藥物對小鼠的 LD50 或最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）。
半數致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗條件下引起 50%受試動物死亡的劑量。該值是經統計學處理所得的結果。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動物死亡的最高劑量。

服務內容：

1、 小鼠急性毒性預試驗，確定合理劑量設計
2、 可根據受試藥物特點選擇合適的給藥途徑，包括灌胃、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射等
3、 對部分可疑動物進行病理組織學檢查

客戶提供：受試樣品;

我們提交：詳細實驗報告;

服務周期：根據實驗方案確定，請谘詢;

服務收費：根據實驗方案確定，請谘詢;

服務特點：1.通過預實驗確定給藥劑量及組間劑量比；2.不同給藥途徑滿足不同受試藥物測定需要。

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一、概述

動物急性毒性試驗（Acute toxicity test，Single dose toxicity test），研究動物一次或24小時內多次給予受試物後，一定時間內所產生的毒性反應。擬用於人體的藥物通常需要進行動物急性毒性試驗。急性毒性試驗處在藥物毒理研究的早期階段，對闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。急性毒性試驗所獲得的信息對長期毒性試驗劑量的設計和某些藥物Ⅰ期臨床試驗起始劑量的選擇具有重要參考價值，並能提供一些與人類藥物過量急性中毒相關的信息。
急性毒性試驗的設計，應該在對受試物認知的基礎上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應根據化合物的結構特點、理化性質、適應症特點和試驗目的等選擇合理的試驗方法，設計適宜的試驗方案，並結合其它藥理毒理研究信息對試驗結果進行全麵的評價。
急性毒性試驗應符合一般動物試驗的基本原則，即隨機、對照和重複。

二、基本概念

最大無毒性反應劑量：即未見毒性反應劑量（No observed adverse effect level,NOAEL），指受試物在一定時間內，按一定方式與機體接觸，用靈敏的現代檢測方法和觀察指標未發現損害作用的最高劑量。
最小毒性反應劑量：動物出現毒性反應的最小劑量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動物死亡的最高劑量。
最小致死劑量（Minimal lethal dose, MLD）：引起個別受試動物出現死亡的劑量。
半數致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗條件下引起50%受試動物死亡的劑量。該值是經統計學處理所得的結果。

三、研究內容

（一）受試物
急性毒性試驗的受試物應采用製備工藝穩定、符合臨床試驗用質量標準規定的樣品，並注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等，並附有研製單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應標明批號、規格和生產廠家，並符合試驗要求。
（二）動物
1.種屬：不同種屬的動物各有其特點，對同一藥物的反應會有所不同。齧齒類動物和非齧齒類動物急性毒性試驗所得的結果，無論是質還是量上均會存在差別。從充分暴露受試物毒性的角度考慮，應從齧齒類動物和非齧齒類動物中獲得較為充分的安全性信息。因此，急性毒性試驗應采用至少兩種哺乳動物。一般應選用一種齧齒類動物加一種非齧齒類動物進行急性毒性試驗。若未采用非齧齒類動物進行急性毒性試驗，應闡明其合理性。
2. 性別：通常采用兩種性別的動物進行試驗，雌雄各半。若采用單性別動物進行試驗，則應闡明其合理性。
3. 年齡：通常采用健康成年動物進行試驗。如果受試物擬用於兒童或可能用於兒童，建議必要時采用幼年動物進行試驗。
4. 動物數：對於所用的動物數，應根據動物的種屬和研究目的來確定。動物數應符合試驗方法及其結果分析評價的需要。應在獲得盡量多信息的前提下，使用盡量少的動物數。
5. 體重：動物初始體重不應超過或低於平均體重的20%。
可根據試驗目的及受試物的特點，確定實驗動物的性別和年齡等。動物應符合國家有關規定的等級要求，來源、品係、遺傳背景清楚，並具有實驗動物質量合格證。
（三）給藥途徑
給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會有所不同，因此需要采用不同給藥途徑進行急性毒性試驗。另外，通過對不同途徑給藥所得結果進行比較，可以獲得一些初步的生物利用度信息。通常，給藥途徑應至少包括臨床擬用途徑和一種能使原形藥物較完全進入循環的途徑（如靜脈注射）。如果臨床擬用途徑為靜脈給藥，則僅此一種途徑即可。經口給藥前動物一般應進行一段時間（通常一夜）的禁食，不禁水。因為胃內容物會影響受試物的給藥容量，而齧齒類動物禁食時間的長短會影響到藥物代謝酶的活性和受試物腸道內吸收，從而影響毒性的暴露。
（四）給藥劑量水平
急性毒性試驗的重點在於觀察動物出現的毒性反應。可選擇適當的方法進行急性毒性研究，對於非齧齒類動物給予出現明顯毒性的劑量即可，給藥劑量沒有必要達到致死水平。
總體上，給藥劑量應從未見毒性劑量到出現嚴重毒性 (危及生命的) 劑量，同時設空白和/或溶媒（輔料）對照組。
不同動物和給藥途徑下的最大給藥容量可參考相關文獻及實際情況來確定。
（五）觀察時間及指標
給藥後，一般連續觀察至少14天，觀察的間隔和頻率應適當，以便能觀察到毒性反應出現的時間及其恢複時間、動物死亡時間等。觀察的指標包括一般指標（如動物外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物等）、動物死亡情況（死亡時間、瀕死前反應等）、動物體重變化（給藥前、試驗結束處死動物前各稱重一次，觀察期間可多次稱重）等。記錄所有的死亡情況、出現的症狀，以及症狀起始的時間、嚴重程度、持續時間等。
（六）病理學檢查
所有的試驗動物均應進行大體解剖，包括試驗過程中因瀕死而處死的動物、死亡的動物以及試驗結束時仍存活的動物。任何組織器官出現體積、顏色、質地等改變時，均應記錄並進行組織病理學檢查。

四、數據分析及評價

（一）結果處理和分析
1.根據所觀察到的各種反應出現的時間、嚴重程度、持續時間等，分析各種反應在不同劑量時的發生率、嚴重程度。根據觀察結果歸納分析，判斷每種反應的劑量－反應及時間－反應關係。
2. 判斷出現的各種反應可能涉及的組織、器官或係統等。
3.根據大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學檢查的結果，初步判斷可能的毒性靶器官。組織病理學檢查應附有病理學檢查負責人簽名和藥品注冊申請人蓋章的報告及有病變組織的病理照片。
4.根據不同劑量組各種毒性反應及發生率、動物死亡情況等，確定動物對受試物的無毒性反應劑量和嚴重毒性反應劑量。為此，建議采用適當的試驗方法來測定最大無毒性反應劑量或最小毒性反應劑量，最大耐受劑量或近似致死量或最小致死劑量等，以初步判斷受試物的安全範圍。
5. 對於需要測定LD50的藥物，應采用合理的統計學方法對其進行求算。
6. 說明所使用的計算方法和統計學方法，提供所選用方法合理性的依據。
（二）綜合評價
根據各種反應在不同劑量下出現的時間、發生率、劑量-反應關係、不同種屬動物及實驗室的曆史背景數據、病理學檢查的結果以及同類藥物的特點，判斷所出現的反應與藥物作用的相關性。總結受試物的安全範圍、出現毒性的嚴重程度及可恢複性；根據毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學檢查的結果，初步判斷毒性作用靶器官。
急性毒性試驗的結果可作為後續毒理研究劑量選擇的參考，也可提示一些後續毒性研究需要重點觀察的指標。此外，根據不同途徑給藥時動物的反應情況，初步判斷受試物的生物利用度，為劑型開發提供參考。

五、急性毒性試驗常用試驗方法

由於受試物的化學結構、活性成分的含量各異，毒性反應的強弱也不同，研究者應根據受試物的特點，選擇以下方法或國內外公認的試驗方法。
1. 近似致死劑量法
該方法主要用於非齧齒類的動物試驗。試驗方法如下：
一般采用6 隻健康的Beagle 犬或猴。犬的年齡一般為4-6 月齡，猴的年齡一般為2-3 歲，選用其他動物時應說明理由。
根據小動物的毒性試驗結果、受試物的化學結構和其它有關資料，估計可能引起毒性和死亡的劑量範圍。按50%遞增法，設計出含數個劑量的劑量序列表。
根據估計，由劑量序列表中找出可能的致死劑量範圍，在此範圍內，每間隔一個劑量給一隻動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然後用二者之間的劑量給一隻動物。如果該劑量下動物未發生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的範圍為近似致死劑量範圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的範圍為近似致死劑量範圍。

2. 最大給藥量法
對於某些低毒的受試物可采用該方法。在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24 小時內多次給藥(劑量一般不超過5g/kg 體重)，觀察動物出現的反應。一般使用10-20 隻動物，連續觀察14天。

3. 固定劑量法（Fixed-dose procedure）
該方法最初於1984 年由英國毒理學會提出，不以死亡作為觀察終點，而是以明顯的毒性體征作為終點進行評價。
試驗選擇5、50、500和2000mg/kg四個固定劑量進行試驗，特殊情況下可增加5000mg/kg劑量。實驗動物首選大鼠，給藥前禁食6-12小時，給受試物後再禁食3-4小時。采用一次給藥的方式進行。如無資料證明雄性動物對受藥試物更敏感，首先用雌性動物進行預試。根據受試物的有關資料，從上述四個劑量中選擇一個作為初始劑量；若無有關資料可作參考時，可用500mg/kg作為初始劑量進行預試，如無毒性反應，則用2000mg/kg進行預試，此劑量如無死亡發生即可結束預試。如初始劑量出現嚴重的毒性反應，即降低一個檔次的劑量進行預試，如此時動物存活，就在此兩個固定劑量之間選擇一個中間劑量試驗。每個劑量給一隻動物，預試一般不超過5隻動物。每個劑量試驗之間至少應間隔24小時。給受試物後的觀察期至少7天，如動物的毒性反應到第7天仍然存在，尚應繼續觀察7天。
在上述預試的基礎上進行正式試驗。每個劑量至少用10隻動物，雌雄各半。根據預試的結果，在上述四種劑量中選擇一個可能產生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進行試驗，如預試結果表明，5.0mg/kg 引起死亡，則降低一個劑量檔次進行試驗。
給受試物後至少應觀察2周，根據毒性反應的具體特點可適當延長。對每隻動物均應仔細觀察並詳細記錄各種毒性反應出現和消失的時間。給受試物當天至少應觀察記錄兩次，以後可每天一次。觀察記錄的內容包括皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環、自主活動及中樞神經係統行為表現等。動物死亡時間的記錄要準確。給予受試物前、後各1周、動物死亡及試驗結束時應稱取動物的體重。所有動物包括死亡或處死的動物均應進行屍檢，屍檢異常的器官應作組織病理學檢查。固定劑量試驗法所獲得的結果，參考下表標準進行評價。

4. 上下法（階梯法，序貫法，Up and down method）
該方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce又進行了改進，目前是OECD和EPA推薦的方法之一。其最大的特點是節省實驗動物，同時，不但可以進行毒性表現的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合於能引起動物快速死亡的藥物。該方法分為限度試驗和主試驗。限度試驗主要用於有資料提示受試物毒性可能較小的情況。可以從與受試物相關的化合物或相似的混合物或產品中獲得相關毒性資料。在相關毒性資料很少或沒有時，或預期受試物有毒性時，應進行主試驗。
限度試驗：是最多用5 隻動物進行的序列試驗。試驗劑量為2000 mg/kg，特殊情況下也可使用5000 mg/kg。
2000 mg/kg劑量水平的限度試驗: 將受試物給予1 隻動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，依次將受試物給予另外4隻動物，動物總數為5隻。如果1 隻動物在試驗後期死亡，而其他動物存活，應停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察，是否在相似的觀察期間也發生死亡。後期死亡的動物應與其他死亡的動物同樣計數，對結果進行如下評價: 有3 隻或3 隻以上動物死亡時，LD50小於2000mg/kg；有3隻或3隻以上動物存活時，LD50大於2000 mg/kg；如果有3 隻動物死亡，則進行主試驗。
5000mg/kg劑量水平的限度試驗:特殊情況下，可考慮使用5000mg/kg的劑量。將受試物給予1隻動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，將受試物給予另外2隻動物。如果這2隻動物都存活，則LD50大於5000mg/kg，停止試驗（即不再對其他動物給藥，觀察14天）。如果這2隻動物中有1隻死亡或者2隻均死亡，將受試物給予另外2隻動物，一次1隻。如果1隻動物在試驗後期死亡，而其他動物存活，應停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察，是否在相似的觀察期間也發生死亡。後期死亡的動物應與其他死亡的動物同樣計數，對結果進行如下評價。有3隻或3 隻以上動物死亡時，LD50小於5000 mg/kg；有3 隻或3 隻以上動物存活時，LD50大於5000 mg/kg。
主試驗:由一個設定的給藥程序組成，在此程序中，每次給藥1隻動物，間隔至少48小時。給藥間隔取決於毒性出現時間、持續時間和毒性的嚴重程度。在確信前一隻動物給藥後能存活之前，應推遲按下一劑量給藥。時間間隔可以適當調整，但使用單一時間間隔時，試驗會更簡便。
第一隻動物的給藥劑量低於LD50的最接近的估計值。如果該動物存活，第二隻動物給予高一級劑量；如果第一隻動物死亡或出現瀕死狀態，第二隻動物給予低一級劑量。劑量級數因子應選定為1/（劑量-反應曲線斜率估計值）的反對數（對應於斜率2的級數因子為3.2），並應在整個試驗過程中保持不變。當沒有受試物的斜率的有關資料時，使用3.2為劑量級數因子。使用默認級數因子時，劑量應從以下序列中選擇：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求時1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。如果沒有受試物的致死估計值，應該從175mg/kg開始。如果預期動物對該受試物的耐受程度變化很大（即，估計斜率小於2.0），那麽開始試驗前應考慮增加劑量級數因子超過按對數劑量計算的默認值0.5（即，級數因子為3.2）。同樣，對於已知斜率很陡的受試物，應選擇小於默認值的級數因子。
在決定是否及如何對下一隻動物給藥之前，每隻動物都應認真觀察達48小時。當滿足停止試驗標準之一時，停止給藥，同時根據終止時所有動物的狀態計算LD50估計值和可信區間。 用最大可能性法計算LD50值 (美國EPA開發了相應的計算軟件，AOT425StatPgm)。
當滿足下列停止試驗標準之一時，停止試驗：
（a） 連續3 隻動物存活；
（b） 任意連續6 隻試驗動物中有5 隻連續發生存活/死亡轉換；
（c） 第一隻動物發生轉換之後至少有4 隻動物進入試驗，並且其LD50估算值的範圍超出臨界值（2.5 倍）。（首次轉換的第4 隻動物之後，對每次給藥進行計算）。
對於LD50和斜率的各種組合，在動物發生死亡/存活轉換之後，用4~6隻動物即可滿足停止試驗標準（C）。但在一些情況下，化合物的劑量-反應曲線的斜率較小，可能另外還需要增加動物（總共可達15 隻）。

5. 累積劑量設計法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非齧齒類動物進行急性毒性試驗可采用此方法。經典的試驗設計需要8 隻動物，分對照組和給藥組，每組4隻動物，雌雄各2隻。
劑量的設計可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸加大，直到出現動物死亡時或達到劑量上限時為止。
當沒有動物死亡時，MLD（最小致死劑量）和LD50大於最高劑量或受限製劑量。當在某一劑量所有動物均出現死亡時，MLD和LD50應在最後兩個劑量之間。當在某一劑量部分動物出現死亡，部分死亡出現在後繼的下一個高劑量，此時，MLD位於首次出現死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應在首次出現動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間。假如沒有動物死亡發生，常常以最高劑量給予動物5-7 天，以確定後續的重複給藥試驗中高劑量的選擇。

6. 半數致死量法
是一種經典的急性毒性試驗方法，試驗結果經統計學處理可獲得受試物的LD50。