非臨床藥代動力學/臨床前藥代動力學

非臨床藥代動力學研究是通過動物體內、外和人體外的研究方法，揭示藥物在體內的動態變化規律，獲得藥物的基本藥代動力學參數，闡明藥物的吸收、分布、代謝和排泄的過程和特點。非臨床藥代動力學研究的主要內容包括血藥濃度-時間曲線測定、吸收、分布、排泄、血漿蛋白結合、生物轉化、對藥物代謝酶活性的影響等。

一、實驗動物的選擇及試驗方法

（一）實驗動物

非臨床藥代動力學研究最好選擇遺傳背景清楚、體內代謝過程與人相似的動物。幼年、高齡、孕期、疾病模型動物可用於研究不同年齡、生理、病理狀態下的藥代動力學規律，無特殊要求時一般選擇成年、健康動物。對於特定性別用藥或性別差異對藥代動力學有影響的藥物，可在特定性別或分別在兩種性別的動物中進行試驗。對於經胃腸道給藥的藥物，一般應在給藥前禁食12h，並在試驗中注意根據具體情況統一給藥後禁食時間，以避免由此帶來的數據波動及食物的影響。經口給藥時不宜選用兔等食草動物。

（二）實驗方法

非臨床藥代動力學研究的一般方法是按臨床擬用的給藥途徑，給予動物一定劑量的某受試物，測定其體液(血、尿、膽汁、糞便、組織、乳汁、唾液、腦脊液、房水等)中藥物濃度隨時間的變化情況，從而了解受試物在動物體內的藥代動力學特征。由於藥代動力學已經參與到新藥研發中藥物的發現階段，發展高通量的藥代篩選技術開始受到普遍重視。目前這項工作主要是利用體外和體內兩種手段開展研究。
體外研究手段主要是圍繞胃腸道吸收特性、代謝速率和程度，以及與代謝酶相關的藥物相互作用等進行。

常用的體外模型和方法有：

  用從人結腸癌組織培養出的Caco-2細胞株或犬腎來源的MDCK細胞評價藥物的吸收特性；

  用動物的腸組織建立組織流通池模型和外翻腸模型來評價藥物的腸吸收特性；

  用肝細胞或肝微粒體作為酶源，通過酶動力學法或多時間點法評價藥物的代謝特點；

  應用肝切片、肝細胞、亞細胞組分及cDNA重組的CYPs等酶源對藥物進行P450酶抑製篩選。體外篩選模型具有速度快、成本低的特點，但試驗結果與體內真實情況存在相關性的問題，並且無法獲得一些重要的藥代參數。

為了增加藥代動力學篩選通量，還可以對動物體內試驗方案進行合理的簡化，減少所需分析的生物樣品數量。目前主要有以下兩種方案：盒式給藥方案和樣品混合方案。

盒式給藥方案是由BermanJ等於1997年提出的。將n個化合物做成混合的給藥溶液給動物用藥，在不同時間點收集血樣，建立這n個化合物同時分析的方法，同時檢測這些化合物在體內的濃度，從而可以同時得到這些化合物的藥代動力學參數。將這種方案用於藥代篩選可以減少需要分析的生物樣品數量，減少實驗動物用量，利用同一隻動物比較多個化合物的藥代特征。但盒式給藥方案也有明顯的局限性：首先，要找到合適的溶媒，保證這些化合物能同時給藥；其次，要建立多個化合物同時檢測的分析方法，增加了分析方法建立和驗證的難度；此外，化合物之間可能存在相互作用，從而影響試驗結果的準確性。

樣品混合方案比較多用的有兩種方式：

  ①等時間點混合法。將不同的化合物給予不同動物，在給藥後相同時間點收集這些動物的血樣，並把不同化合物在相同時間點的血樣混合，同時檢測這些化合物的血藥濃度。這一方法的主要優點是對於不同的化合物可以采用不同的給藥劑型，對給藥劑量也不需要像盒式給藥那樣考慮得很多，可以減少需要分析的樣品數量，避免藥物相互作用對試驗結果的影響。當然由於生物樣品在分析前進行混合，對分析方法的靈敏度提出了更高的要求，動物實驗的工作量也高於盒式給藥。

  ②同隻動物樣品混合法。不同的化合物給予不同動物後，在等時間段的固定時間點收集血樣，並把同隻動物的樣品等體積混合，通過測定混合後樣品的濃度進行藥代篩選。這種方法可以快速得到化合物給藥後在體內的藥—時曲線下麵積，從而可以把所研究的化合物按生物利用度的高低進行排序。但這個方法不能得到完整的藥-時曲線，因而得不到一些重要的藥代參數，如Tmax、Cmax等。所以這種方法比較適合於早期的藥物發現階段，可篩選具有合適的口服生物利用度的化合物。

由於在吸收、分布、代謝和排泄方麵與人非常相似的動物種屬幾乎是不存在的，目前從動物研究結果準確預測藥物在人體的所有藥代動力學特征是不可能的。然而，在某些合理定義的前提下，作出一些合理的預測是可能的。例如，某藥物通過胃腸道的吸收特征在種屬間可能是相似的，因為上皮細胞的性質在哺乳動物之間是相似的，並且吸收過程主要取決於藥物和生物膜之間的相互作用。然而pH依賴的溶解性、首關效應等影響吸收的限速步驟和因素在種屬之間存在差異，從而導致吸收的種屬差異。應用人和動物的腎小球濾過率比率來預測藥物在人體的腎排泄也是相對成功的，同樣，如果某藥物主要通過肝消除，其消除速率受肝血流速度所限，則可用肝血流速度來預測藥物在人體的清除率。然而蛋白結合和藥物的代謝轉化等參數僅有很小的可預測性，這些參數在種屬之間顯著變化。在結合非臨床藥效學和毒理研究結果預測藥物在人體的有效性和安全性時，血藥濃度和藥-時曲線下麵積是相關性最好的指標。

二、動物藥代動力學研究設計

動物藥代動力學研究是創新藥物研究的一個重要方麵，其研究結果對新藥的後續研究有著重要的指導意義，因此，其實驗設計、樣品測定及結果處理都必須遵循科學合理的指導原則。下麵從實驗動物的選擇、給藥劑量/方式的選擇、樣品的采集、樣品測定及結果處理幾個方麵來進行闡述。

（一）實驗動物的選擇

藥代動力學研究常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴、小型豬等。可根據研究的需要和受試物的作用特點、研究目的、藥物濃度測定方法、樣本的種類和數量等選擇適宜的動物，並盡可能與藥效學和毒理學研究所用的動物一致。小動物的生理參數、肝和腎的髒器指數高於大動物，體循環速度也快於大動物，因此進行血藥濃度測定時一般首選非齧齒類的大動物，而組織分布和排泄研究一般可采用操作方便的小鼠、大鼠。
以每個采樣點不少於5個數據為限計算所需動物數。最好從同一動物個體多次取樣，盡量避免多隻動物的合並樣本。如受其他因素製約，一隻動物不能滿足多次取樣需要，由多隻動物的數據共同構成一條血藥濃度—時間曲線時，應相應增加動物數，以反映個體差異對試驗結果的影響。

（二）給藥劑量及給藥途徑

血藥濃度測定一般在有效劑量到安全劑量範圍內至少選擇3個劑量，其高劑量最好接近最大耐受劑量，中、低劑量根據動物有效劑量的上下限範圍選取，避免劑量過於集中。主要考察在所測試的劑量範圍內，藥物的體內動力學過程是屬於線性還是非線性，以利於解釋藥效學和毒理學研究中的發現，並為新藥的進一步開發和研究提供信息。分布和排泄研究一般選擇一個有效劑量進行試驗。
藥物經不同途徑給藥時，其體內動力學過程不同，為了更好地提示藥物在人體內的情況，動物藥代動力學研究所用的給藥途徑和方式，應盡可能與臨床擬用方案一致。

（三）樣品采集

采樣點的確定對藥代動力學研究結果有重大影響，若采樣點過少或選擇不當，得到的結果可能與藥物在體內的真實情況產生較大差異。

1. 血樣采集

給藥前需要采血作為空白樣品。為獲得給藥後的一個完整的血藥濃度—時間曲線，采樣時間點的設計應兼顧藥物的吸收相、平衡相(峰濃度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2~3個采樣點，對於吸收快的血管外給藥的藥物，應盡量避免第一個點是峰濃度(Cmax)；在Cmax附近至少需要3個采樣點；消除相需要4~6個采樣點。整個采樣時間至少應持續3~5個半衰期，或持續到血藥濃度為Cmax的1/10~1/20。為保證最佳采樣點，在正式試驗前，選擇2~3隻動物進行預試驗，然後根據預試驗的結果，審核並修正原設計的采樣點。

2. 組織樣本采集

參考血藥濃度-時間曲線的變化趨勢，選擇至少3個時間點分別代表吸收相、平衡相和消除相，采集心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、生殖腺、腦、體脂、骨骼肌等組織樣本進行藥物濃度測定。采集時注意樣本的一致性和均一性，即每隻動物盡可能在同一部位取樣，以避免藥物在不同部位分布差異造成的誤差。較大的髒器如肝可在預試驗時多點取樣，以了解藥物在整個髒器的分布情況，避免誤差。取樣後的組織先經仔細修理，去掉脂肪、黏膜等外圍組織，精確稱重後進行粉碎、勻漿等處理。

3. 尿樣和糞樣采集

將動物放入代謝籠內，選定一個有效劑量給藥後，按一定的時間間隔分段收集尿或糞的全部樣品。糞樣晾幹後稱重(不同動物糞便幹濕不同)，按一定比例製成勻漿，記錄總體積，取部分樣品進行藥物含量測定。
應采集給藥前尿及糞樣，並參考預試驗的結果，設計給藥後收集樣品的時間點，包括藥物從尿或糞中開始排泄、排泄高峰及排泄基本結束的全過程。

4. 膽汁收集

一般用大鼠在乙醚麻醉下作膽管插管引流，待動物清醒後給藥，並以合適的時間間隔分段收集膽汁，進行藥物測定。

（四）樣品測試

藥代動力學研究中測試的生物樣品較常見的有血、尿、膽汁、糞便、組織、乳汁、唾液、腦脊液、房水等。生物樣品的測試方法包括色譜法、放射性核素標記法、免疫學和微生物學方法。應根據受試物的性質，選擇特異性好、靈敏度高的測定方法。色譜法包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜法(gas chromatograph，GC)和液相/氣相色譜liquid / gas chromatograph，LC/GC)與質譜(mass spectrum，MS)聯用的方法(如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS等)。在需要同時測定生物樣品中多個化合物的情況下，LC-MS/MS和GC-MS/MS聯用法在特異性、靈敏度和分析速度方麵有更多的優點。

對於前體藥物或有活性(藥效學活性或毒理學活性)代謝物的藥物，建立方法時應考慮能同時測定原型藥和代謝物，以考察物料平衡，闡明藥物在體內的轉歸。在這方麵，放射性核素標記法和色譜-質譜聯用法具有明顯優點。

應用放射性核素標記法測定血藥濃度可配合色譜法，以保證良好的檢測特異性。如某些藥物難以采用上述的檢測方法，則可選用免疫學或生物學方法，但要保證其可靠性。

放射免疫法和酶標免疫法具有一定特異性，靈敏度較高，但原型藥與其代謝物或內源性物質常有交叉反應，需提供證據說明其特異性。

生物學方法(如微生物法)常能反映藥效學本質，但一般特異性較差，應盡可能用特異性高的方法(如色譜法)進行平行檢測。

生物樣品測定的關鍵是方法學的確證。方法學確證是整個藥代動力學研究的基礎，所有藥代動力學研究結果都依賴於生物樣品的測定，隻有可靠的方法才能得出可靠的結果。通過準確度、精密度、特異性、靈敏度、重現性、穩定性等研究建立了測定方法，得到標準曲線後，在檢測過程中還應進行方法學質控，製備隨行標準曲線並對質控樣品進行測定，以確保檢測方法的可靠性。

（五）數據處理

動物藥代動力學研究的內容多，所得的各種數據量大，試驗後需匯總的數據如下：

1. 血藥濃度和藥-時曲線

記錄各個動物在每個時間點的血藥濃度，分別繪製血藥濃度-時間曲線；計算各劑量組動物在每個時間點血藥濃度的平均值及標準差，分別繪製各劑量組的血藥濃度-時間曲線。多次給藥時，還需提供各個(和各組)受試動物的3次穩態穀濃度數據、血藥濃度達穩態後末次給藥的血藥濃度-時間數據和曲線。

2. 藥代動力學參數

根據試驗中測得的各受試動物的血藥濃度-時間數據，采用藥代動力學專用的計算機程序求得受試物的主要藥代動力學參數，如Cmax(峰濃度)、Tmax(達峰時間)、T1/2(消除半衰期)、Vd(表觀分布容積)、AUC(血藥濃度-時間曲線下麵積)和CL(清除率)等。其中，Cmax、Tmax采用實測值，AUC采用梯形法計算可以更客觀地反映藥物在體內的實際情況。另外，統計矩參數如MRT(平均滯留時間)和AUC(0-∞)等，對於描述藥物藥代動力學特征也是有意義的。

3. 組織分布數據

記錄各組織/髒器吸收相、平衡相和消除相時間點的藥物濃度數據；分別繪製各劑量組、各組織/髒器的血藥濃度-時間曲線；以柱形圖等形式匯總和比較各組織/髒器的藥物分布情況，分析藥物分布的規律和特點。

4. 排泄數據

記錄各時間段收集的尿、糞、膽汁等排泄物中的藥物濃度和樣品體積或重量，計算每個時間段的藥物排出量、累積量、總排出量及經各排泄途徑排出的藥物占總給藥量的比例。

5. 血漿蛋白結合率

測定動物和人在不同藥物濃度下的血漿蛋白結合率。

6. 代謝數據

記錄血漿及各種排泄物中主要代謝物的種類和含量，分析藥物在體內生物轉化的類型、主要轉化途徑及可能涉及的代謝酶。藥物對藥物代謝酶，特別是細胞色素P450同工酶的誘導或抑製作用。

有效整合各項試驗數據，選擇科學合理的數據處理及統計方法。如用計算機處理數據，應注明所用程序的名稱、版本和來源，並對其可靠性進行確認。

對所獲取的數據進行科學和全麵的分析與評價，綜合論述藥物在動物體內的藥代動力學特點，包括藥物吸收、分布和消除的特點；經尿、糞和膽汁的排泄情況；與血漿蛋白結合的程度；藥物在體內蓄積的程度及主要蓄積的器官或組織；闡明藥物在體內的生物轉化、消除過程及物質平衡情況。分析藥代動力學特點與藥物的製劑選擇、有效性和安全性的關係，為藥物的整體評價和臨床研究提供更多有價值的信息。

（六）非臨床藥代動力學研究在藥物開發階段的應用

非臨床藥代動力學研究在藥物發現、藥理及毒理研究、臨床試驗等階段均有所體現。

首先，在新藥篩選和設計的初期，得到了一係列候選化合物之後，除了要通過簡單的藥效學試驗考察其藥效活性外，還要考慮藥代動力學方麵的因素。例如，是否容易轉運到藥效作用部位(如中樞神經係統用藥應能通過血腦屏障)、是否有合適的半衰期、口服吸收是否良好(以便選擇合適的給藥途徑)等。代謝途徑是否複雜也會成為決定是否進一步開發的考慮因素，因為代謝途徑複雜的藥物將增加不同種屬及不同人群間的藥效與毒性的不可預測性，給進一步的開發帶來困難和風險。不同的取代基團可能引起不同的生物轉化，可以通過定向結構改造來改變藥物的藥代動力學特征，使其更有利於臨床應用。因此在新藥篩選當中可選擇一些有可能成為候選藥物的代表性化合物，用少量動物或體外試驗係統(Caco-2細胞模型、體外肝係統等)進行部分藥代動力學研究，以初步考察其吸收、代謝情況。

動物體內藥代動力學研究是藥理和毒理研究的重要組成部分，也是非臨床藥代動力學研究的主體，在臨床前提供了最大量的藥代信息，來支持對新藥的評價和進一步開發。

對於創新藥物，臨床前要進行代謝方麵的研究，特別是作為前藥的藥物，由於在體內產生藥效和毒性的是其活性代謝物，臨床前需要對其活性代謝物的結構、數量、代謝途徑等進行深入細致的研究。但對於以代謝消除為主的藥物，其代謝的目的僅僅是消除，代謝物不具有生物活性，考慮到代謝研究的複雜和艱巨，部分研究(如代謝物的定量)可在臨床試驗期間完成。對代謝酶的影響、藥物相互作用等研究，根據藥物的具體情況，有些研究可在臨床試驗前完成，有些也可在臨床試驗期間完成，並且需要結合臨床研究的一些結果進行試驗設計和綜合評價。例如在人體藥代動力學研究中若發現有明顯的種族差異，或與動物研究結果有種屬差異，可能需要返回來進行代謝途徑和代謝酶的研究，為臨床試驗結果提供合理的解釋；如果在Ⅲ、Ⅳ期臨床試驗中發現所開發的品種與聯合使用的其他藥物有相互作用，可能需要返回來考察藥物對代謝酶的誘導或抑製作用、藥物與蛋白結合的競爭或抑製等。另外，通過代謝研究，可提示代謝的種屬差異，為合理選擇安全性評價的動物提供依據，若發現人體內可能產生動物沒有的主要代謝物，則需要進行該代謝物的安全性評價。

非臨床藥代動力學研究在新藥的研發與評價中起著重要的橋梁作用。非臨床藥代動力學與藥物化學、藥劑學、藥效學、毒理學和臨床研究是密切聯係的，通過這些聯係，把這些分支學科結合在一起，形成新藥研發與評價的大學科。

非臨床藥代動力學研究是藥劑學研究的主要依據和工具之一，進行劑型選擇時也要考慮藥代因素，如口服吸收不好、首關效應明顯的藥物不適合做成口服製劑。可以通過藥代比較研究(生物利用度或生物等效性)來考察製劑處方和工藝的合理性，例如可通過局部吸收研究考察用於皮膚給藥的製劑處方中促滲透劑含量的合理性；通過動物體內藥代動力學比較研究(與常釋製劑或已上市緩釋製劑比較)來初步考察緩釋製劑處方工藝的可行性等。另一方麵，劑型特征、具體製劑所使用的輔料、製備工藝等也是影響藥代的重要因素，因此也可以通過藥劑學手段改變藥物的某些藥代性質，使其更符合臨床用藥的需求。

在藥效學方麵，非臨床藥代動力學研究可提供藥物濃度與藥效的關係；說明藥效反應的種屬差異在藥代方麵的原因；提供藥物分布與藥效的關係；解釋不同給藥途徑與藥效的關係。

在毒理學方麵，非臨床藥代動力學研究可提供藥物濃度與毒性反應的關係(毒代動力學研究範疇)；提示可能的毒性靶器官，例如在組織分布研究中發現骨髓蓄積，則應考慮骨髓可能是毒性靶器官，在後續毒理試驗中要相應增加對造血功能、血細胞形態學的考察指標；代謝物研究可能提示毒性作用機製，例如大劑量對乙酰氨基酚可導致肝壞死，代謝研究發現對乙酰氨基酚的主要代謝物是羥基化產物，該羥基化產物與穀胱甘肽結合而解毒，但在過量的情況下，剩餘的羥基化產物還會與肝細胞內的酶和調節蛋白結合，從而導致肝損傷。
非臨床藥代動力學研究得到的藥代動力學參數(如半衰期)、代謝信息(代謝途徑、產物、酶等)可為設計和優化臨床給藥方案提供有關依據。