Ames試驗-細菌回複突變試驗

ICH推薦的標準遺傳毒性試驗組合

組合一

    a.細菌回複突變試驗
b.體外染色體畸變試驗或體外微核試驗或體外小鼠淋巴瘤tk試驗，這三個試驗可以任選其中一個。
c.體內微核試驗或體內骨髓細胞染色體畸變試驗；動物給藥後取外周血淋巴細胞做細胞遺傳學分析也可接受，但不常用。

組合二

    a.細菌回複突變試驗
b.用兩種不同組織做體內遺傳毒性評估，通常包含體內微核試驗和另一個體內試驗。第二個體內試驗通常選擇評估動物肝髒DNA鏈斷裂。
細菌回複突變試驗是與致癌物檢測最相關的體外試驗。

細菌回複突變(Ames)試驗

•             用於檢測DNA損傷引起的基因突變。通過檢測受試物在測試菌株某些特殊構建的突變體上引起突變的能力，即造成菌株從組氨酸/色氨酸依賴型向原養型突變，判斷受試物是否為致突變劑。

•             試驗需在加和不加s9代謝活化係統條件下同時進行。

•             ※在培養細菌的瓊脂培養基中加入痕量的組氨酸或色氨酸，允許細菌前幾個小時生長，表現為背景菌苔。當加入的組氨酸/色氨酸用盡後，隻有發生了突變的細菌才可以繼續生長成為肉眼可見的回複突變菌落。

不同類型的Ames試驗

GLP試驗用標準Ames試驗。
在藥物篩選早期常用的試驗有Mini-Ames試驗、Micro-Ames試驗、AmesII試驗等，特點是用藥量少。
Mini/Micro Ames試驗通常選擇2個菌株（即TA98和TA100，可檢測98%致突變劑），為了消除另外2%的可能性，可選擇與標準Ames試驗相同的5個菌株。
AmesII試驗使用菌株TA98和混合菌株TA7001至7006，將細菌與受試物預培養及一係列稀釋後，在30℃培養過夜，然後接種到各有選擇性試劑5-FU及pH敏感劑溴甲酚紫的384孔上，通過紫外分光光度計檢測培養基變黃的程度來判斷受試物致突變性。

Ames試驗流程

受試物		澆到平板，孵育48-72小時
菌液
S9混合物/PBS

測試菌株（Ames Test System）

應選擇至少5種菌株

•             TA1535

•             TA1537或TA97或TA97a

•             TA98

•             TA100

•             WP2 uvrA或WP2 uvrA(pKM101)或TA102

每種菌株在編碼組氨酸/色氨酸生物合成的操縱子上有不同的突變。
國外較多實驗室選用WP2，而國內使用TA102較多。

測試菌株基因型和突變類型

測試菌株基因型及檢測敏感性

Rfa膜突變的存在增加了細胞膜對大分子化學物質的通透性
uvrB-菌株的切除修複功能有缺陷，菌株無法切除DNA加合物，是的這些菌株對大量致突變劑的致突變性和細菌毒性敏感。
質粒pKM101上含有muc+基因，參加DNA損傷誘導的DNA修複途徑，在給予細菌抵抗致突變劑的細菌毒性同時，提高了易突變性。含有質粒pKM101的菌株自發回複突變菌落數較高。

TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重複序列，位於相應的組氨酸靶位點內的突變敏感部位，他們對導致這些移碼熱點中堿基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似。

TA98和TA100對大部分致突變劑敏感（有數據顯示這兩個菌株檢測陽性的致突變劑占98%，因而在前期篩選試驗中可隻檢測這兩個菌株。）
羥基蒽醌類化合物僅可被菌株TA1537檢測
氧化型突變劑、DNA交聯劑劑聯氨僅可被含有AT位點突變的菌株TA102、WP2urA、WP2uvrA(pKM101)檢測
菌株TA1535與TA100都在hisG46基因位點發燒堿基置換型突變，不同點僅是TA100含有pKM101質粒，從而增加突變敏感性。但是專家組通過大量數據顯示，在已知的659種致突變劑中約5%受試物僅可被TA1535檢測出，而不是TA100。

溶媒的選擇

•             水：水溶性化合物

•             二甲基亞碸(DMSO)：無水溶性化合物首選

•             乙醇

•             丙酮

•             不常用溶媒：設立平行陰性對照

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