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染色體原位分子雜交技術
染色體原位分子雜交技術 二、探針（probes） 1．基因組探針（Genomic probe）：
人類基因組內一些高頻率的重複序列，在進化上很少具有保守性。若 以基因組DNA作為探針，這些存在於探針和靶細胞順序中的高度重複序列之間會首先退火結合，越過那些保守的餓和單一的序列，故雜交會呈現出種特異性。利用這類探針在人鼠雜交細胞中可特異顯示人的遺傳物質。
2．染色體特異性序列探針（Probe recognizing chromosome specific sequences)：
目前在人幾乎所有染色體中已經克隆出一些重複序列，重複一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區或異染色質區產生致密的雜交帶。從而可特異性地識別某一染色體。
3．染色體文庫探針（chromosome labraries probe）：
染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針或染色體染探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來自僅攜有某一條人類染色體的體細胞雜交株，或經流式細胞分類儀從染色體懸液中分離
4．單一序列探針（single-copy sequences probe）：
FISH有一弱點，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內的單一序列基因，最有效的方法是應用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段），更大的YAC載體（載100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的質粒探針亦可用FISH方法定位，但效率較低。
三、FISH技術係列 1． 24色mFISH核型分析技術
24色mFISH是近年建立的一種新技術。其原理是使用5種熒光染料按比例標記探針，雜交後形成24條染色體各自呈現特異的熒光色彩以供核型分析。為研究人員提供了更豐富詳盡的細胞遺傳學信息，包括確定標記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測複雜的染色體易位，尤其為腫瘤細胞染色體分析提供了全新、高效的方法 。
2．原位雜交顯帶技術(In situ hybridization banding,ISHB)
為了準確定位原位雜交部位所處染色體及其區帶，染色體必須顯帶。但無論是先雜交後顯帶，還是顯帶後雜交，雜交與顯帶過程回互相影響效果。後來人們注意到，人類短間隔插入重複序列中的一種Alu家族，Alu片
段約300bp長，在基因組中重複約九十萬次，平均間隔3-4kb就插入一個。有人利用部分Alu序列作為引物，用PCR方法擴增Alu之間的DNA，稱Alu-PCR法。但Alu序列在基因組內分布不是隨機的，有些區域比較密集，有些區域較稀疏。隻有前者才有PCR產物。人們用Alu-PCR產物作為探針與人類染色體標本雜交，結果得到類似R帶的熒光帶型。故人們在進行基因定位時，隻需將目的探針與Alu-PCR探針同時應用，用不同顏色的熒光標記，就可同時顯示雜交信號和染色體帶型。
3．FISH基因定位（FISH mapping）
基因定位時，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個或兩個以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然後根據它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時與中期染色體雜交，隻要根據兩種顏色雜交位點的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經過折疊和包裝後形成的，若兩個靶序列相距很近， 例如間距小於1Mbp，受包裝過程的影響，它們 在線形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學者們發現，靶序列之間在間期核的平均相對距離與它們在線形DNA分子上的距離呈正相關。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測距的分辨率。
四、FISH的應用 1．基因定位與基因製圖（Gene mapping）
原理前麵已敘述。FISH已經極大地加速了人類基因定位和基因製圖的進程。
2．基因診斷(Gene diagnosis)
精確、直觀、明了
3．間期細胞遺傳學（Interphase cytogenetics）
4．FISH在腫瘤生物學中的應用
（1）腫瘤細胞遺傳學（Onco-cytogenetics）
（2）基因定位：FISH可用於分離出的癌基因與抑癌基因初步定位
（3）病毒基因插入基因組部分的檢測：
雖然逆轉錄病毒以激活原癌基因為主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產物與抑癌基因蛋白產物相互作用而誘導細胞轉化。但病毒基因特別是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因組。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況，對深入研究病毒致癌機理，以及檢測、防治均具有重要意義。
（4）基因的擴增與缺失
原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點。
已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴增、易位、病毒序列插入。
抑癌基因的激活方式有：點突變、基因缺失。
FISH為研究基因的擴增和缺失提供了新的方法，能將基因擴增和染色體重複分開。
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