化合物活性篩選中心篩選模型

2015-10-22

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新藥靶標的可行性評估
高通量篩選和基於結構設計的活性化合物發現
活性化合物到先導化合物的發現
先導化合物的優化到臨床前候選藥物的確定
計算機輔助藥物設計
構效關係研究

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1、抗腫瘤（抗炎）藥物活性篩選

主要模型：

a、體外腫瘤細胞毒篩選模型
b、體內抗腫瘤藥效評價模型（裸鼠移植瘤）
c、一氧化氮（NO）生成抑製劑篩選
d、NF-κ B 信號通路抑製劑篩選
e、wnt 信號通路抑製劑篩選
f、蛋白酶體抑製劑篩選模型
e、Iκ B 激酶-β (IKK-β )抑製劑篩選模型
f、微管蛋白聚合解聚篩選模型
g、組蛋白去乙酰化酶抑製劑篩選模型

藥物活性篩選

篩選模型名稱	主要應用
a、體外腫瘤細胞毒篩選模型	該模型可用於評價化合物對體外腫瘤細胞生長及增殖的抑製活性，也可用來指導精製組分中的抗腫瘤活性單體的追蹤分離，檢測結果準確，重複性好，可高通量進行。
b、體內抗腫瘤藥效評價模型（裸鼠移植瘤）	該模型廣泛應用於抗腫瘤藥物研發，是抗腫瘤藥物研發中的重要環節，結果綜合反映藥物的體內作用效果，為評價化合物的成藥性提供重要的數據。
c、一氧化氮（NO）生成抑製劑篩選	該模型直接評價化合物抑製 NO 生成的活性，適合通量篩選，快速，靈敏。可通過預刺激確證化合物是否作用於 NF-κ B 信號通路，為進一步作用機製的研究提供線索。
d、NF-κ B 信號通路抑製劑篩選	該模型應用雙熒光素酶報告基因係統直接檢測化合物對 NF-κ B 信號通路的抑製作用，方法直接、靈敏，檢測結果是化合物是否作用於信號通路的直接判斷依據。
e、wnt 信號通路抑製劑篩選	該模型應用雙熒光素酶報告基因係統直接檢測化合物對 wnt/β -catenin信號通路的抑製作用，檢測快速，靈敏度高，可高通量進行。
f、蛋白酶體抑製劑篩選模型	該模型針對蛋白酶體複合物的核心 20S 催化顆粒進行篩選，可直接評價化合物對蛋白酶體的抑製活性，檢測靶點明確，快速，靈敏度高。
e、Iκ B 激酶-β (IKK-β )抑製劑篩選模型	該模型直接檢測化合物對 IKK-β 激酶的抑製作用，應用熒光比色的方法，檢測靶點明確，快速，靈敏度高。
f、微管蛋白聚合解聚篩選模型	該模型通過熒光比色直接針對微管蛋白的聚合和解聚過程進行檢測，檢測靶點明確，方法快速，靈敏度高。
g、組蛋白去乙酰化酶抑製劑篩選模型	該模型通過熒光比色直接檢測化合物抑製 HDAC 的活性，檢測靶點明確，方法快速，靈敏度高。

2、神經係統藥物活性篩選

主要模型：

a、乙酰/丁酰膽堿酯酶（AChE/ BuChE）抑製活性篩選模型

b、促進 PC12 細胞化活性篩選模型
c、鈣流活性篩選模型
d、線蟲長壽模型 I
e、線蟲長壽模型 II
f、抗腦缺血藥藥效檢測
g、抗老年癡呆藥藥效檢測
h、抗癲癇藥藥效檢測
i、抗抑鬱藥藥效檢測模型

篩選模型名稱	主要應用
a、乙酰/丁酰膽堿酯酶（AChE/ BuChE）抑製活性篩選模型	該模型以他克林（膽堿酯酶抑製劑）作為陽性對照，化合物與乙酰/丁酰膽堿酯酶的混合液在 30℃反應，乙酰/丁酰膽堿酯酶能夠催化其底物類似物碘化硫代乙酰/丁酰膽堿降解，生成硫代膽堿和乙酸/丁酸，反應生成物與顯色劑 DTNB反應生成黃色物質，在 405nm 處有特異光吸收。如果化合物對乙酰/丁酰膽堿酯酶有抑製作用，那麽乙酰/丁酰膽堿酯酶催化底物類似物碘化硫代乙酰/丁酰膽堿降解的量就會減少，相應的與 DTNB 反應生成的黃色化合物減少，即在 405nm處的光吸收值變小，以此來篩選具有抑製活性的化合物。
b、促進 PC12 細胞化活性篩選模型	該模型以未分化的PC12細胞為實驗對象，采用包被培養方式，以NGF為陽性對照，化合物溶媒作為對照組，誘導72h後，顯微鏡下觀察並記錄PC12細胞分化情況，統計分析細胞分化率（軸索長度≥細胞直徑的細胞百分數）、具有軸索的細胞數、細胞平均軸索數、梭形細胞比例等細胞分化的形態學參數，以此篩選出具有促進PC12細胞分化活性的化合物。
c、鈣流活性篩選模型	該模型以細胞為檢測對象，使用離子指示劑 Fluo 4-AM 作為細胞內 Ca2+的測定技術。Fluo 4-AM 是 Fluo 4 的一種乙酰甲酯衍生物（AM），通過培養，能夠輕易進入細胞中。AM 進入細胞後會被胞內酯酶所水解，產生 Fluo 4，未結合的 Fluo 4 熒光很弱，與遊離的鈣離子(Ca2+)結合後產生強烈熒光。使用 Thermo Scientific 高內涵藥物篩選儀，激發光 485nm，5s 檢測一次，持續檢測 5min，以熒光的變化來判定細胞內鈣離子濃度的變化，從而評價化合物的鈣流活性，為下一步的作用機製研究提供線索。
d、線蟲長壽模型 I	該模型以 TJ356 線蟲株為實驗對象，TJ356 是 daf-16::GFP 轉基因線蟲株，正常情況下，daf-16 分布在胞質，當化合物作用於 Insulin-like 生長因子（IGF）信號通路時，daf-16 轉入核內調控一係列基因的表達，在熒光顯微鏡下可見核內聚集熒光，由此可以確定化合物是否對於該信號通路有作用。
e、線蟲長壽模型 II	該模型以 N2 線蟲株為實驗對象，通過固體培養方式，采用 FUDR 平板表麵給藥的方式，以不作任何處理的 FUDR 平板作為對照，挑入 L4 後期 N2 株線蟲，20℃培養，統計兩種平板培養方法下 N2 株線蟲的壽命，能延長 N2 株線蟲壽命的化合物，可能具有抗衰老活性。
f、抗腦缺血藥藥效檢測	候選藥物配製成注射液，在大鼠再灌注後經注射給藥。在給藥 24 小時和48 小時檢測大鼠行為，48 小時行為檢測後快速取腦切片染色並計算缺血麵積。與模型組相比，如果注射了候選藥物的大鼠在行為評分或腦缺血麵積上有所改善，則說明該候選藥物可能對中風具有潛在的療效。這是目前篩選治療中風藥物較為通用，也是較為可靠的方法。
g、抗老年癡呆藥藥效檢測	本模型用雙轉基因癡呆症模型小鼠（PrP-hApp/hPS1 雙轉基因 AD 小鼠）進行候選藥物活性檢測。該 AD 小鼠在 3 月齡出現認知行為學變化，5 月齡出現老年斑，12 月齡有大量老年斑形成。通過觀察給藥後 AD 小鼠在 Morris 水迷宮實驗中的學習記憶能力，小鼠腦部 AChE 活性和 Aβ 含量來檢測和評價候選藥物抗老年癡呆能力，為候選藥物的進一步臨床研究提供充分的實驗依據。
h、抗癲癇藥藥效檢測	本模型用生理鹽水作為空白對照組，乙琥胺、丙戊酸鈉及苯妥因鈉作為陽性藥對照組，采用給小鼠腹腔注射受試候選藥物，30 分鍾後皮下注射戊四氮，然後以“首次延遲 5 秒的 5 級癲癇發作時間、延遲 5 秒的 5 級癲癇發作次數及死亡情況”三個指標初步評判受試化合物的抗癲癇藥效，為候選藥物的進一步臨床研究提供充分的實驗依據。
i、抗抑鬱藥藥效檢測模型	本模型用 C57BL/6J 小鼠作為研究對象，檢測候選藥物對小鼠在強迫遊泳和懸尾情形下的行為反應。使實驗小鼠在強迫遊泳或懸尾的應激狀態下持續 6分鍾，通過視頻軟件分析、比較後 4 分鍾的不動時間來評價候選藥物的抗抑鬱能力，為候選藥物的進一步臨床研究提供實驗依據。

3、心血管係統藥物活性篩選

體外血液學活性篩選模型

①活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血三項包括凝血酶原時間（PT）和凝血酶時間（TT）是化合物或候選藥物體外抗凝活性的重要檢測指標。APTT主要用來檢測化合物或候選藥物對內源性凝血的影響，PT主要檢測化合物或候選藥物對外源性凝血的影響，TT則是用來判斷化合物或候選藥物對共同凝血途徑的影響。該藥效學模型采用人質控血漿試劑盒法進行凝血三項測試，能夠篩選抗凝血活性化合物。

②血液凝固是一係列凝血因子相互激活形成酶促級聯反應“凝血瀑布”的過程。血漿中有12種凝血因子，這些凝血因子是血液凝固的物質基礎。純因子係統條件下，研究抗凝血化合物或候選藥物對這些凝血因子的活性影響，可以找出化合物或候選藥物的凝血作用機製和作用靶蛋白。本模型采用純人緣凝血因子係統，酶學生色底物反應法測定化合物對凝血因子的影響，以確認化合物的抗凝血作用機製，目前主要包括：AT-III 依賴的抗凝血因子 IIa 和 Xa 活性；HCII 依賴的抗凝血因子 IIa 活性，抗凝血因子 Xase 酶活性，激活凝血因子 XII 活性。

4、治療糖尿病/代謝性疾病藥物活性篩選

a、胰島素增敏活性篩選模型

胰島素（Insulin）作用於肌肉和脂肪細胞後激活其信號通路，從而調動葡萄糖轉運蛋白 4（GLUT4）從胞內向胞膜轉運進而完成葡萄糖攝取。不同的胰島素刺激濃度和 GLUT4 在胞膜上的表達量呈線性關係，故而檢測 GLUT4 的膜轉運率即為檢測胰島素敏感性的指標。

該模型采用過表達 GLUT4 的脂肪細胞作為檢測模型，量化化合物處理後GLUT4 在細胞膜上的分布量。利用 NIKON Ti-E 熒光顯微鏡和 Metamorph Offline

軟件實現對圖像的全自動采集和數據分析。根據化合物的作用時間不同，該模型可以分為急性或慢性檢測。此外，該模型具有靈敏性高、作用靶點明確等特點，是適合初步批量篩選胰島素增敏活性的有效模型。

b、葡萄糖重吸收抑製活性篩選模型

SGLT2全稱為2型鈉/葡萄糖共轉運體,其生理功能是在腎髒近曲小管完成對原尿中約90%的葡萄糖重吸收。SGLT2抑製劑能夠抑製腎髒對葡萄糖的重吸收，通過增加尿糖排泄的方式降低機體血糖。同時，它不依賴於內源性胰島素而發揮作用，降低血糖的同時能降低體重，是治療糖尿病藥物篩選中的一個新靶點。

該模型利用帶發光基團的葡萄糖類似物 2-NBDG 作為指示劑（綠色發光），檢測永生化的人腎近曲小管上皮細胞 HK-2 細胞的葡萄糖攝取情況。因此，該模型對被測化合物抑製 SGLT2 的活性具有提示作用。適合靈敏、批量，快速地初步篩選有抑製活性的化合物。根據化合物作用時間的不同，該模型可以檢測化合物的急性或是慢性抑製活性。

c、減肥活性篩選模型

在正常情形下，脂肪細胞數目到了青春期後就不再增加。成年以後發胖的人，一般是脂肪細胞因儲藏過多脂肪而變大所造成。在人體內，脂肪是以甘油三酯的形式儲存在脂肪細胞內的脂滴中。
油紅 O(Oil Red O)是一種易溶於甘油三酯的染料，可以通過 Oil Red O 染色方法來判斷脂肪細胞中脂肪的積聚水平。該模型采用分化成熟後的 3T3-L1 脂肪細胞作為檢測模型，用 Oil Red O 染色法來檢測脂肪細胞內甘油三酯的含量，從而判斷化合物是否具有脂解作用，進而篩選出有減肥活性的化合物。該方法靈敏、簡便、適合批量篩選。

d、抗胰島素抵抗活性篩選模型

胰島素抵抗（insulin resistance, IR）是胰島素發揮作用的靶器官組織（如脂肪和肌肉細胞）對一定劑量胰島素所產生的生理效應低於正常水平的一種狀態，是2型糖尿病主要發病原因。該模型根據 2 型糖尿病中機體在維持較高胰島素濃度的條件下仍然不能有效發揮其生理效應的特點，用高濃度胰島素孵育脂肪細胞，引起其產生胰島素抵抗。即在相同濃度的胰島素刺激下，與正常細胞相比，產生胰島素抵抗的細胞隻能調動部分葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）上膜，不能有效完成葡萄糖攝取的功能。利用該模型可直接評價化合物抗胰島素抵抗的活性。根據化合物對細胞的作用時間不同，還可以分為急性或慢性檢測。該模型靈敏、靶點準確，適合批量篩選。

5、皮膚化妝品活性篩選

a、B16、HDFa 細胞毒性實驗

通過 MTS 比色法，確定樣品的 CC50 (50% cytotoxicconcentration)，即對50%的細胞產生毒性時的藥物濃度，從而確定以下活性實驗的安全樣品濃度。細胞與樣品共同孵育後，加入 MTS 試劑，MTS 是一種新合成的四唑類化合物，能夠被活細胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性甲瓚產物，其顏色深淺與活細胞數在一定範圍內呈高度相關，通過酶標儀測定其490nm下的吸光值以確定細胞的存活率。與MTT 方法比較，MTS 比色法更加靈敏簡便，快速安全。

b、DPPH 自由基清除實驗

當自由基超過人體的抗氧化防禦能力時，受損的分子和細胞就會急劇增多，氧化損傷隨之產生，進而可能導致炎症、癌症的發生，還會引起皮膚幹燥、暗黃、鬆弛、產生皺紋等。因此篩選具有清除自由基活性的天然產物對於抗衰老化妝品的開發具有一定的意義。

本實驗利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法來評價樣品的體外抗氧化能力。DPPH是一種很穩定的以氮為中心的自由基，在515nm處有強吸收峰，當有自由基清除劑存在時，DPPH 會和清除劑提供的質子結合形成 DPPH-H，從而使溶液顏色由紫色變為黃色，在 515nm 處的吸光度變小。以此來篩選具有體外抗氧化能力的天然產物。

c、酪氨酸酶活性抑製實驗

酪氨酸酶是黑色素生成過程中的主要限速酶，其活性與黑色素的合成量成正相關。研發能抑製酪氨酸酶活性的物質將成為治療色素沉著性疾病的重要手段。
多巴在酪氨酸酶催化下轉變為多巴醌，多巴醌有兩種代謝途徑，第一種繼續轉變為黑色素，第二種與半胱氨酸相互作用後轉變為褐黑素。樣品如果能夠抑製酪氨酸酶的活性，即可間接抑製黑色素的生成，並且在 490nm 處的吸光值會變小，據此篩選具有抑製酪氨酸酶活性的樣品。

d、B16 細胞黑色素生成抑製實驗

黑色素是由黑素細胞合成分泌的，廣泛存在於人的皮膚、粘膜、視網膜、軟腦膜及膽囊與卵巢等處，黑色素分泌失調容易導致雀斑、黃褐斑、黑變病等疾病，因此篩選具有黑色素抑製活性的天然產物對於美白化妝品的研發具有重要意義。
本實驗所選細胞為小鼠黑色素瘤細胞（B16細胞），因為B16細胞的基本結構，特別是黑色素合成功能與人體正常的黑素細胞基本一致，因此B16細胞可作為比較理想的篩選模型。黑色素在 405nm 處有強吸收峰，當樣品抑製 B16 細胞黑色素分泌時，吸光值會減小，以此計算黑色素生成抑製率。

e、促膠原蛋白分泌實驗

膠原蛋白是動物體內最豐富的蛋白，占人體皮膚蛋白質的 71.2%。皮膚中一旦缺乏膠原蛋白，膠原纖維就會發生交聯固化，細胞間黏多糖減少，皮膚失去彈性並變薄老化，因此篩選能夠促進膠原蛋白分泌的天然產物對於抗衰老化妝品的研發具有一定的意義。
皮膚中主要以 I 型膠原蛋白為主，而 I 型膠原蛋白的分泌水平可以通過I型前膠原蛋白的分泌水平體現，所以本實驗通過檢測I型前膠原蛋白的方法來計算I型膠原蛋白的分泌增加率。

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