包涵體蛋白純化和複性

包涵體：在某些生長條件下，基因工程菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體。（Inclusion Bodies，IB）。

包涵體的組成及特性

一般含有50%以上的重組蛋白，其餘為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，隻溶於變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體與蛋白種類及表達係統無關，僅為蛋白過量表達的結果。

包涵體形成的主要原因

1、表達量過高：原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能完全正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。       

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體 

3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高（37-42℃）或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
4、重組蛋白是大腸杆菌的異源蛋白，由於缺乏真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

分離純化細菌包涵體蛋白質的基本步驟

                   蛋白質產物的構象複原等。

             (Recovery of target protein conformation)

    包涵體蛋白純化和複性的步驟

蛋白質的複性是重組蛋白純化中最關鍵和最複雜的問題。蛋白質的性質不同，所處的環境不同，使其複性條件大不相同。任何一個蛋白質都有一個最佳的複性條件，隻有選擇到了合適的複性緩衝液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完成。 

hjc黄金城包涵體蛋白複性特點

活性蛋白的回收率高
正確的複性的產物易於與錯誤的折疊蛋白質分離。
折疊複性後應得到濃度較高的蛋白質產品
複性過程耗時少

複性常用方法

1、稀釋複性：直接加入水或複性緩衝液，缺點是體積增加較大，後續處理困難。
稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體（較低的複性收率）。有時需低於0.01mg/mL。
脈衝流加複性：分批次加入到緩衝液中，使折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-10mg/mL終濃度下，溶菌酶複性收率可達80%以上。
2、透析複性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控製變性劑去除速度，速度慢，不適合大規模操作，無法應用到生產規模。
3、超濾複性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質通不過。在生產中較多的使用，規模較大，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集於膜上）。
4、色譜複性：輔助手段，兼具分離。
4.1凝膠過濾複性：除了蛋白質在膠粒中傳質和擴散外，蛋白質與介質之間並沒有發生其他作用。該法可以起到一定的抑製凝集作用，並且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些蛋白質的複性有利。
4.2吸附型層析複性：離子交換、疏水層析、親和層析和擴張床層析均屬於吸附層析。其基本複性原理是層析柱平衡後，將變性蛋白上樣並吸附在凝膠介質上，然後用清洗緩衝液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最後用複性緩衝液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成複性。
5、分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽酰一輔氨酰順反異構酶等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細胞內調節蛋白質的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質的折疊複性。

    體內複性主要是在工程菌培養過程中同時加入分子伴侶的基因進行共表達；體外複性主要是將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫助折疊。

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