PCR技術服務及其運用

PCR產物的檢測

• 凝膠電泳分析：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳
• 酶切分析
• 分子雜交：Southern印跡雜交、斑點雜交
• 核酸序列分析

PCR的反應條件

• 反應溫度（變性、退火、延伸）
• 反應時間（變性、退火、延伸）
• 循環次數（PCR效率及產物量）

PCR反應的特點

• 特異性強：引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性  
• 靈敏度高：指數增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 
• 簡便、快速：2～4 小時完成擴增
• 對標本的純度要求低：DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板 

1.1 PCR技術概述及原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA為模板，以特定的核酸片段即PCR引物為擴增起點和終點，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外體係中複製出大量與母鏈模板中所需的DNA片段互補的子鏈DNA的過程。
PCR的最大特點是其擴增產物的特異性、擴增效率的靈敏性、擴增程序的簡便性。引物序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵。PCR技術是一種DNA體外合成放大技術，具有擴增效率高，擴增特異性高，擴增體係和技術簡便成熟的特點，是當今生物學相關實驗室最廣泛使用的一項技術。

1.1.1 PCR的循環步驟

PCR反應過程實際上是一個溫度循環變化的過程，一般包括變性---退火---延伸三個基本反應步驟，其基本步驟如下：
（1）模板DNA的變性：模板DNA經加熱至92～96℃以上保溫1～3分鍾，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；雖然變性時間決定於多種因素模板DNA的複雜性、反應管的幾何學、PCR儀的種類甚至反應體積，但是實際經驗中，94℃保溫3分鍾即可以滿足絕大部分反應的需求。另外，對於GC含量較高的DNA模板，加入甘油、延長時間、應用核酸類似物可以提高PCR產物的產量。
（2）模板DNA與引物的退火(複性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，37～65℃保溫0.5～1分鍾，寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；這一步的溫度取決於引物與靶序列的同源性程度和寡核苷酸引物的堿基組成。引物的摩爾數由於絕對大於靶序列，因此它們與互補序列的配對速度在反應中比模板雙鏈之間的重新配對要快幾個數量級。
（3）引物的延伸：DNA模板---引物結合物體係在68～72℃延伸保溫相應時間（此步驟具體溫度視熱穩定DNA聚合酶的種類而定，而保溫時間則在考慮DNA聚合酶效率的基礎上，依據反應產物的長度決定，如目前最常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分鍾約可以擴增長度為1Kb左右的DNA片段，因此要擴增兩2Kb的DNA片段時本步驟的保溫溫度應設置為72℃、時間為2分鍾），在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。

重複循環變性---退火---延伸三過程，就可獲得更多的“半保留複製鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板使得每個循環中新擴增的目的片段數量以指數式增長。經過一定數量的循環之後，待擴目的DNA片段的數量將被擴增放大幾百萬倍。到達平台期所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。

1.1.2 PCR一般反應體係

PCR反應的組分一般包括：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四種脫氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反應緩衝液、Mg2+等。目前，PCR反應已經全部在PCR儀中進行，且普遍采用商業化的PCR試劑盒進行PCR反應，因此一般研究者隻需要準備自己的模板DNA和PCR引物，然後按照產品說明書進行操作即可；對於PCR係統各個組分的了解是進行PCR實驗的基礎，尤其是在擴增結果不理想的時候，可依此改進實驗以獲得滿足實驗需求的擴增結果。

一般普通的PCR反應體係中主要包括下列組分：
（1）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，通常標準分子生物學方法製備的樣品都可以直接作為模板使用，無需特別處理，但應盡量不含有對PCR反應有抑製作用的雜質存在，如蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑製劑、能與DNA結合的蛋白質。需要指出的是，模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。另質粒、預先擴增的到的片段等小片段DNA作模板時，擴增的效率會明顯高於基因組DNA為模板的反應，因此在使用小片段DNA作模板時，要盡量降低模板的量，10-9g至10-12g級即可。
（2）引物：引物在PCR反應中的終濃度一般為1μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產物或產量過低。商業公司合成的幹粉狀引物一般可用ddH2O或溶解為100μmol/L，－20℃儲存，使用時按比例加入體係即可。
（3）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為10mmol/L，各成份以等當量配製，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。需要說明的是，dNTPs的濃度改變會影響有效的Mg2+濃度，因此若dNTPs得濃度增加，Mg2+濃度亦應該增加。
（4）鎂離子：Mg2+能影響反應的特異性和PCR的產率。Mg2+的工作濃度為1.5～2.0mM，其對應dNTP為200μmol/L；以Taq酶為例，由於dNTP與Taq酶競爭Mg2+，當dNTP濃度達到1mmol/L時會抑製Taq酶的活性。鎂離子的使用是嚴格的，其作用優於錳離子，鈣離子則無效。
（5）無Mg2+buffer：主要有H2O、KCl、Tris組成。Tris用於控製反應體係中的pH值，保障DNA聚合酶的反應活性；不超過50mM的KCl可以降低退火溫度，但是過高的KCl會抑製DNA聚合酶的活性。
（6）DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR擴增得以進行的保證，目前的PCR技術中使用的都是熱穩定性酶，避免了PCR技術應用初期需在每一次變性後重新加酶的繁瑣工作。目前最常用的Taq酶能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。Taq酶的缺點是沒有3’→5’的外切酶活性，因此沒有校正功能，某種dNTP或Mg2濃度過高,會增加其錯配率，因此在進行精密PCR實驗室，建議使用有3’→5’的外切酶活性的高保真的聚合酶。聚合酶的用量一般按試劑盒說明書的推薦用量添加即可。
除了以上標準成分以外，一些研究者或者試劑盒推薦在體係中添加明膠、TritonX-100或BSA（小牛血清白蛋白）來增加酶的穩定性，可能的原因是它們起著減少PCR管對聚合酶的吸附作用，以使聚合酶盡可能參與到反應中。
另外，甘油、二甲亞碸、甲酰胺可以提高特異性,這些成分可能是通過降低解鏈和鏈分離溫度使模板變性更容易並提高了引物退火特異性來實現提高PCR反應特異性的目的。

1.2引物設計

1.2.1 PCR引物設計的一般思想

PCR反應擴增成功的一個關鍵即是引物的正確設計，尤其在目前已有大量PCR試劑盒免去研究人員對實驗體係、條件的繁複摸索的條件下，研究者隻需自行準備模板和引物即可。
引物設計的核心思想是在擴增的特異性和效率之間取得平衡。特異性指擴增得到非目標片段的頻率；擴增效率指在每一個循環中一對引物引起的擴增產物的產量與理論上應獲得的產量的接近程度。
目前市麵上提供大量的引物設計軟件，這些軟件基本都基於以下幾點考慮引物質量：可能引起非靶序列的假陽性擴增，引物本身的發卡結構，引物二聚體的形成等，假陽性擴增與引物特異性相關，引物發卡結構和二聚體的形成對擴增效率有較大影響。

1.2.2引物的組成

引物的主體通常是一段5’→3’的與靶序列嚴格互補的寡核苷酸短鏈，根據實驗的不同目的，許多時候會在引物的5’添加限製性酶識別位點等與本次PCR無關序列或其它各種修飾,這些修飾通常不會影響引物的第一次正常退火和擴增，而在後續的循環中，由於已有可互補的模板，體係亦可正常進行擴增。

1.2.3引物設計時應考慮的幾個因素

（1）引物長度：PCR擴增的特異性由引物的長度和退火溫度控製，當反應的退火溫度接近Tm值時，18～24個堿基長度的引物有著卓越的特異性。
理論上認為在引物上每增加一個堿基特異性會增加4倍，因此引物越長堿基數越多特異性越突出，但是引物越長，退火時可以被其引發的模板也會越少，再經過指數擴增期放大後，擴增產物會明顯減少。因此若非特殊需要，一般引物的互補序列部分不需要超過25個堿基。
而引物越短，其在退火時結合到靶序列上的幾率就越高，因此引物中與靶序列互補部分堿基太少會引起不必要的非目標擴增產物。
（2）GC%和Tm值：Tm值指的是引物與模板結合的雙鏈體的解鏈溫度。較低的Tm值導致引物特異性的喪失，這種情況下將出現大量的非特異性擴增產物。Suggs在1981年提出的Tm＝2（A+T）+4（C+G）公式，由於簡便和相對精確一直受到廣大研究者的好評。對於一條大約20個堿基的引物，基於上述公式，可以發現當CG%在50%左右時Tm值約在56℃～62℃，較適合進行PCR反應，因此在設計引物時，應選取（A+T）和（C+G）數量大致相當的序列。尤其應注意使上下遊兩條引物的Tm值盡量接近，比較理想的情況是相差2～3℃以內，這樣可以使PCR反應中進行退火時上下遊引物結合靶序列的效率相當，以獲得穩定且足夠數量的擴增產物。
需要特別指出的是，在進行PCR反應設置退火溫度時，不管是公式推算還是軟件預測或者引物合成公司提供的Tm值，實際上都隻能用於參考，每一個PCR反應的實際退火溫度理論上都是未知的，通常第一次擴增時退火溫度設置為參考Tm值+2或4℃，之後根據擴增結果進行調整。
（3）引物在靶序列內的位置：除了有特定而精確的目的片段以外，大部分的實驗中，PCR反應的產物長度是可以在一定範圍內進行適度選擇的，根據PCR產物的用途、模板的特點和所用聚合酶的特性，可以選擇合適的產物長度，一般實驗中的PCR反應通常選擇在150～1000bp之間，而若隻是為了檢查某段特異性序列則隻需要120～300bp就已足夠。
在靶序列上選擇引物的時候，注意避開成串單一堿基的區域，避開連續的CG序列，盡量選擇四個堿基分布較隨機的區域，這樣可以減少引物自身同源的機會，避免擴增過程中引物的不必要消耗；同時在上下遊兩引物之間也不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區有同源性。另外尤其要注意3’末端的序列，若非有特定作用，這段序列一定要與模板DNA嚴格配對，末位堿基最好選用A、C、G，因為T錯配也能引發鏈的延伸。

1.3 PCR的特異性、效率和忠實性

PCR的特異性、效率和忠實性是體現一個PCR實驗的質量的三個重要指標。特異指一個PCR反應隻產生一個擴增產物，即預期的靶序列。效率指每個循環裏擴增的實際產物的量與理論上應該達到的量的接近程度。忠實是指在PCR反應過程中，由DNA聚合酶誘導的錯配是可以忽略不計的。
這三個參數中的每一個都受到PCR反應中眾多成分的影響，包括緩衝體係、酶、模板甚至PCR循環程序，但最遺憾的是，高特異性的反應條件與高產量的反應條件並不一致，同時高保真也往往導致低產率。因此在設計PCR實驗時，要根據實驗目的，有針對性地對這三個參數有側重地優化。如在片段長度多態性分析時，PCR產物的產量和特異性就比忠實性重要；而若是研究個別DNA分子或稀有突變，忠實性的重要性不言而喻。
特異性是PCR的基礎，它首先取決於引物設計與模板的精確互補。一套理想的引物能有效地與靶序列雜交，而與模板中出現的其它序列的雜交可以忽略不計。一般引物與模板中非靶序列發生4個或更少連續堿基互補都不會在電泳時體現出來。
PCR反應的效率影響特異性產物的積累，根據Chien等人給出的靶序列的累積與循環數的函數關係，擴增效率最高的時期為29個循環之前的指數增長期，之後每次循環的效率就開始大大降低，產物停止指數積累，此時理論上靶序列的拷貝數已達到1012，而1012拷貝的特定序列對於絕大多數分子生物學實驗已滿足要求，且PCR的許多應用尤其是定量實驗都要求擴增在指數生長期完成，因此，一般PCR反應都在29個循環之前取出，沒有必要再增加循環數。
PCR反應的忠實性主要與酶有關，雖然可以通過改變反應緩衝液的條件大大提高忠實性，但是也遠比不上更換高保真的聚合酶的效果。聚合酶的高保真能力體現在其擁有3’→5’的外切酶校正活性。需要指出的是，不論是否使用高保真的聚合酶，PCR的過程都有可能有錯誤堿基滲入，因此在對忠實性有要求的實驗中，經PCR得到的序列必須測序驗證。

1.4 PCR的優化

在PCR實驗中，最顯而易見的一對矛盾是擴增時產生大量不確定、不需要的產物，或者沒有擴增到任何產物，這個矛盾的實質就是PCR的高特異性和高效率所需的條件不一致。
下麵給出有利於增加PCR特異性的部分條件，往反方向調整即可增加擴增效率，但是會降低特異性，因此最佳目標是尋得兩個方向之間的平衡。

有利於增加PCR特異性的調整條件：
（1）使用熱啟動技術
（2）使用降落PCR技術
（3）優化引物設計
（4）加入或優化增強劑
（5）優化反應體係，包括pH值，甚至改變反應體積
（6）提高退火溫度
（7）提高模板的變性效率
（8）降低Mg2+濃度
（9）降低dNTPs的濃度
（10）降低聚合酶的量
（11）降低引物濃度
（12）降低模板濃度
（13）減少循環數
（14）減少每個循環中各部分的時間
如上所述，通常影響一個PCR反應的條件很多，因此，在實際操作中假如進行全矩陣分析尋找最佳條件將費時費力，因此，研究過程中可以隻針對相關的主要變量進行調整。在重點考慮引物與模板的配對及酶的忠實性的情況下，Mg2+濃度和退火溫度是對擴增影響最顯著的因素，因此可以隻針對這兩個變量進行簡單的小矩陣分析。降落PCR實質上就是一個在係列梯度溫度中尋找到有效退火溫度，並適度保證特異性的方法。

1.5 PCR常見問題

PCR產物的電泳檢測與保存
PCR結束後最好立即檢測，一般不要超過48小時；產物保存於－20℃待用，或者純化後保存。

假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環節有：（1）模板核酸的製備；（2）引物的質量與特異性；（3）酶的質和量；（4）PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：（1）模板中含有雜蛋白質；（2）模板中含有Taq酶抑製劑；（3）模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體中的組蛋白；（4）在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚；（5）模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：（1）選定一個好的引物合成單位；（2）引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度；（3）引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效；（4）引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl，或100μl，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μl 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性，退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性，出現擴增條帶與目的靶序列條帶一致
有時出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：（1）整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（2）空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拚接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶
PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：（1）引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。（3）酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或塗抹帶
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：（1）減少酶量，或調換另一來源的酶。（2）減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環次數。

1.5 PCR的應用

PCR技術自1985年建立以來，發展迅速，表現出極其廣泛的應用價值.基於PCR的基本原理，許多學者充分發揮創造性思維，對PCR技術進行研究和改進，使PCR技術不僅得到了進一步地成熟完善，更在此基礎上派生出了許多新的應用領域與方法。

PCR技術首先在基因工程領域有著不可替代的貢獻：
對DNA片段在按特殊要求進行修飾上PCR技術提供了一種比原有技術更快更簡單的方法。因為與重組DNA技術相比，PCR技術本身就較為簡單；而且它還可以通過化學合成寡聚核苷酸引物的方法更為簡便地改變DNA的堿基序列，而不需對DNA片段進行限製性內切酶和連接酶操作；再者，PCR技術還可能很方便地進行序列改造，如在引物5'端加上一個“添加”序列。此外PCR技術產生的修飾產物效率幾乎可達100%。
此外通過PCR引物引入DNA序列變異的原理是非常有用的。最為簡便的是它可以使PCR產物的一條鏈或另一條鏈或兩條鏈都特異性地標記上放射同位素、生物素或熒光素。它還可以在DNA序列的任一位置上特異性地進行位點替代、缺失、插入或重組，同時它還可以將本來毫不相關的序列準確地連接起來，並由此獲得可遺傳的突變。
近年來，基於PCR的各種新技術不斷更新、完善、發展，如原位PCR技術、連接酶鏈反應技術（Ligase chain reaction，LCR）、依賴核酸序列的擴增技術（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉錄依賴的擴增係統（Transcript-based amplification system，TAS）、標記PCR技術（Labelled Primers，LP-PCR）、彩色PCR技術（Color Complementation assay PCR，CCAPCR）、反向PCR技術（reverse PCR）、不對稱PCR技術（asymmetric PCR）以及目前熱火朝天的實時熒光定量技術（real time PCR）等等，不僅應用在科研領域，也在動、植物檢疫、食品安全、司法鑒定等社會生活中的方方麵麵有著越來越大的應用價值。希望通過自己的努力，使其成為一名玩PCR的高手。

【主要參考書目】
（1）C.W.迪芬巴赫，G.S.德維克斯勒，PCR技術實驗指南．科學出版社：北京，2000
（2）薩姆布魯克 J，弗裏奇 E F，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆實驗指南．第二版．北京：科學出版社，1998