腎功能衰竭動物模型

慢性腎功能衰竭（CRF）是指慢性腎髒病引起的腎小球濾過率下降及與此相關的代謝紊亂和臨床症狀組成的綜合征。運用動物模型有助於有效地認識CRF的發生、發展規律和研究防治措施。近年來隨著實驗研究的深入，CRF實驗動物模型的造模方法有了更多的經驗和進一步的發展。本文對近年來建立CRF實驗動物模型的研究方法做一綜述。

1、物理方法

1.1 腎大部分切除法
腎切除模型曆史悠久，早在1952年Platt等利用大鼠行5/6腎切除成功製作了CRF動物模型。我國沙朝暉等報道的大鼠5/6腎切除法采用二期手術：大腿肌內注射麻醉大鼠，選取背左側切口，暴露左腎，剝離腎包膜，將腎的上下極各1/3切除，明膠海綿壓迫切麵止血。一期手術後7d，行二期手術，摘除右腎。術後90d穩定於氮質血症期。王瑞強等采用弧型切除2/3腎組織，主要切除皮質部分。1周後切除整個右腎，2次手術共切除腎髒80%左右，8周後造模成功。
5/6腎切除製備CRF模型符合腎小球高灌注、高濾過、高壓力致腎衰的學說，本模型以腎小球肥大、硬化為主要特點，表現出與人類腎髒纖維化一致的過程，故模型表現接近臨床，研究減輕腎組織灌注、高濾過及抑製係膜細胞增殖的藥物可采用此模型。本模型到實驗8周時可出現低鈣高磷等一係列腎性骨病改變，提示本模型亦可作為一種腎性骨病的研究模型。但本模型需要做二期手術，手術操作複雜，需掌握切除腎組織技術，不應切到腎盂，以免尿液外漏。且該造模方法易引起出血、感染甚至死亡，模型製備時間長。另外亦有3/4、6/7、7/10等腎切除法，不同模型的生化指標及病理損傷均表現為慢性腎功能衰竭，但模型不如5/6腎切除模型穩定。

1.2 冷凍加切除法
成年健康雄性大鼠，以腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，左側背部切口分離肌層，暴露出左腎，剝離腎筋膜，將已浸入液氮瓶內的冷刀依次對腎髒外側前、後及上、下極4個部位冷凍，每處冷凍40s，複位腎髒，縫合手術切口，2周後摘除右腎。術後6～12周呈現穩定的CRF模型。王剛等報道了采用大耳白兔，使用上述方法冷凍45s或60s，該方法術後4周即可造模成功。楊鵬等采用改良的左腎上下極結紮加外側皮質冷凍加右腎切除法，雖然血清肌酐（Scr）水平較高，但8周後動物病死率明顯增高。
此模型是針對5/6腎切除模型對切除技術要求高和易出血、易感染的缺點而設計的。本模型可通過控製冷凍時間來製備不同病變程度的CRF，但有研究表明腎冷凍後有自身抗體產生，其引起的自身免疫反應亦會導致腎髒病變。另一方麵冷凍時間、冷刀放置位置及接觸麵積大小均可影響病變，造成差異，需尋求一個統一標準，減少病變差異。

1.3 熱透加切除法
1973年Souhami建立了單純透熱法模型，1985年Gibb等在此基礎上進行改進，提出透熱右腎加左腎切除的方法。我國肖煒等報道運用該方法具體操作過程為腹腔麻醉小鼠，做背右側切口，暴露右腎被膜後，用電灼燒器簡單燒灼腎皮質，然後用絲線結紮，切除上、下極，2周後行左腎全部切除，模型成功約需10周。王耀光進一步改良，從腎的上極開始，點刺燒灼腎的上下極、前後兩麵除腎蒂以外的所有皮質部分，前後2次燒灼的間距約1 mm，1周後切除右腎。手術10 d後SCr、尿素氮（BUN）均顯著升高。
本模型造成大部分腎小球、腎小管組織結構破壞，最終形成腎小球硬化。因其貧血在腎衰後第1周出現，第2周可達最低點，尤其適合CRF貧血的研究。本模型製作方法簡單，可重複性好，模型成功率高，一般可達到中重度CRF程度。其不足之處是電凝麵積、深度難掌握，若灼刺過深則使組織炭化，BUN波動大，壞死組織存留體內所致的幹擾因素不能排除。若透熱程度掌握不佳，亦可導致動物死亡。

2、化學方法

2.1 腺嘌呤模型
高濃度腺嘌呤在體內通過酶促反應形成2，8-二羥基腺嘌呤，沉積在腎小管，影響氮質化合物的排泄，導致氮質血症，最終引起CRF。該造模方法由Yokozawa於1986年首先報道，目前應用廣泛。耿靜按腺嘌呤300mg/（kg·d）對Wistar雄性大鼠灌胃21d，結果發現SCr、BUN及24h尿蛋白定量均顯著升高，腎小管上皮細胞腫脹、壞死、脫落，間質纖維化，炎症細胞浸潤，少數小球廢棄，符合人類腎衰竭疾病模型。李根林等[11]認為2.5%腺嘌呤混懸液按250mg/（kg·d）連續灌胃14d後，再改為隔日給藥14d，Wistar雄性大鼠模型可出現腎功能中重度損傷，酸中毒，符合慢性腎功能不全尿毒症期表現。劉洪彥等報道雄性Wistar大鼠腺嘌呤150mg/（kg·d）灌胃12周可成功構建具備貧血、高血壓、脂代謝及鈣磷代謝紊亂多種常見並發症的CRF大鼠模型，並發現腎功能為不可逆轉的慢性進展；而以腺嘌呤300mg/（kg·d）灌胃的大鼠則出現急性腎損害的特點，未出現CRF常見並發症。 不同的腺嘌呤給藥劑量及療程會導致不同程度的腎功能減退，出現不同的並發症，如臨床研究CRF鈣磷代謝紊亂、高血壓等慢性並發症，最好腺嘌呤150 mg/（kg·d）灌胃，而且療程應較長；還應注意大鼠品係對實驗結果的影響，不同品係的大鼠可能對腺嘌呤反應不同。此外，該模型以腎小管破壞為主要病變特征，可運用於對一些恢複腎小管功能的新藥的研究。但本模型因劑量加大可造成其他髒器的損害而受到限製，造模有時需加腎部分切除。

2.2 阿黴素模型
阿黴素可使腎髒近曲小管上皮細胞受損，基質和膜性細胞器變性，溶酶體功能超負荷，細胞核崩解。脫落的小管上皮細胞與管腔內的蛋白質構成管型，堵塞管腔，引起腎小管內壓增高，最終形成CRF。目前采用的多是改良阿黴素腎病大鼠模型，楊維娜等在實驗開始第4、18天時分別於SD大鼠尾靜脈注射阿黴素4mg/kg，12周末可見部分腎小球硬化，腎間質纖維化，SCr、BUN明顯升高，出現腎功能衰竭。劉韻璐等比較了二次尾靜脈注射阿黴素及單側腎摘除加術後重複尾靜脈注射阿黴素所致大鼠腎病模型，認為後者臨床表現更典型，穩定性及重複性更好。
本模型病理改變為進展性腎小球腎病，此模型用於藥物的開發及藥效學研究，研究降低腎小管壓力，改善蛋白尿、低蛋白血症以及減輕腎小管上皮細胞損傷等機製。同時有報道該模型根據阿黴素注射次數及劑量可造成不同程度的腎髒改變，臨床工作者可根據自身要求合理選擇。考慮到阿黴素較強的毒副作用不推薦單次大劑量注射阿黴素造模，二次尾靜脈注射法動物死亡率低，簡便，能夠動態觀察從微小病變腎病到局性節段性腎小球硬化的進展過程；單側腎摘除加術後重複尾靜脈注射法可以進一步減少阿黴素的毒副作用，但可能會因手術意外增加病死率。

2.3 柔紅黴素模型
阿黴素為柔紅黴素的衍生物，故該模型製備原理與阿黴素相似。傳統方法采用柔紅黴素12mg/（kg·d）給大鼠做尾靜脈注射，4～6周成模。林娜等在此基礎上進行改進，左側腎髒切除術後第7、14天分別由尾靜脈注射12mg/kg柔紅黴素，後按每天1次灌胃給藥，6周後造模完成。該模型可以出現腎病綜合征表現，後期可見氮質血症。腎髒病理示腎小球硬化，腎小管透明變性、萎縮甚至壞死。本模型製作周期較短，穩定性較好，也可以觀察到自早期的微小病變到後期的局灶階段性腎小球硬化和慢性腎功能不全。

2.4 氯化鎘模型
鎘主要經腎髒排泄，慢性鎘中毒時，鎘滯留於腎髒，損傷腎小管及腎小球，而成CRF。袁立煥等用含氯化鎘1g/kg的混合飼料喂養小鼠，結果小鼠腎功能和腎組織損害明顯，並呈進行性加重，成功製作了CRF模型。用藥15d後，模型動物SCr、BUN上升，腎髒病理可見近曲小管上皮細胞變性，腎間質可見炎症細胞浸潤，腎小球有核細胞數目增多。用藥125d後可見部分腎小球纖維化。

2.5 消痔靈模型
章如虹等報道該模型的具體造模方法：腹腔麻醉大鼠，分別用消痔靈稀釋液注入雙側腎髒，需一次注射完成。從腎髒下極進針至中極偏上極處，盡量朝向腎皮質，針尖斜麵朝向皮質，注射速度要緩慢（每次至少注射1min），拔針後碘酒棉球壓迫針孔3min以上。術後10周後造模成功，SCr及BUN進行性升高。16周時病理檢查可見普遍的腎小球纖維化、間質纖維化，殘存腎小球相互靠攏。消痔靈注射模型簡便易行，無感染，造模創傷小，成功率高，並可通過控製注射劑量來製作輕、中、重不同程度的CRF模型，其病理改變符合人類CRF固縮腎的特點，但該方法所需的注射技木給造模造成難度，且仍不能避免壞死組織存留體內所產生的幹擾因素。

3、生物學方法

本模型在1982年由Border等成功建立，因該模型形成原位免疫複合物型腎小球腎炎，故早期主要運用於腎炎的實驗研究。我國由何立群等首次運用於CRF的研究，采用新西蘭兔耳緣靜脈注射C-BSA及大腸杆菌內毒素做預免疫，1周後注射C-BSA 25 mg/d，持續5周，然後隔日注射C-BSA 25 mg，再持續5周造模成功。周寶寬等在此基礎上進行改進，由耳靜脈注射C-BSA 25 mg/d，第4周起注射劑量增至50 mg/d，共6周後造模成功。薛繼平等報道，將C-BSA 25 mg溶於2 mL磷酸鹽緩衝液中，經耳緣靜脈每日注射1次，持續8周模型建成。
此種方法與物理方法相比，它能模擬人類疾病的自然發病和病程及轉歸，是研究疾病自然發展轉歸及檢測藥物療效的良好實驗對象。本實驗中，隨著注射時間的延長和C-BSA在體內的蓄積量逐漸增加，家兔日漸消瘦、蜷縮弓背、精神萎靡、體毛脫落。腎髒的形態學結果顯示，腎髒體積變化經曆了一個先增大後縮小的過程。該模型的製備過程中C-BSA的製備工藝相當重要，周寶寬等優化了傳統的C-BSA製備工藝，加入硫酸銨增強陽離子化的穩定性，提高了C-BSA的純度。

4、討論

近年來CRF的動物模型無論從物理、化學、生物學方法，還是三者互相結合共同製備，造模技術均在不斷完善。但實際上，在每一種動物模型的製作過程中，動物的種係、模型製作技術、飼料、飼養方法都會對造模的結果產生影響。①種係方麵：製作模型時應考慮不用種係的敏感性問題，動物不同，病理變化也不同。3個月的Wistar大白鼠與PVG/C大白鼠單腎切除後，腎小球硬化有種係間的差異。②模型製作技術方麵：物理方法造模時，操作要熟練，最好由一人操作，減少誤差；手術時注意防止損傷腎上腺；切除腎髒最好在腹膜外進行，減少感染概率。化學方法造模時，藥物對機體其他髒器產生的影響亦不容忽視。生物方法造模時需注意保護動物耳緣靜脈，因長時間注射C-BSA會造成靜脈損傷甚至硬化。③飼料方麵：CRF與食物有不可分割的關係，高蛋白飲食引起的動物模型蛋白尿明顯高於正常飲食組，腎小球的硬化亦較正常飲食組嚴重。④飼養方法：在造模的過程中應關注動物房的溫度濕度、食物的新鮮度、進食次數等。綜觀CRF動物模型的多種造模方法，雖造模技術在不斷完善，但對動物模型的客觀評價仍不足。以人類慢性腎衰的分期來界定CRF動物模型有一定局限性，模型評價指標不統一，模型出現腎損害程度常常輕重不等，模型動物缺乏對腎衰的良好耐受性，通常實驗研究過程中可出現動物死亡。因此，進一步探索更加符合人類CRF病理變化特點，規範動物模型的診斷與療效標準，尋求統一、穩定、簡便的動物模型仍將是CRF實驗研究中需要解決的重要問題，而這一問題的進展將推動整個CRF實驗研究。