hjc黄金城細胞凋亡檢測技術服務

    上海hjc黄金城的生物部在體外生物學領域擁有豐富的經驗，通過酶水平測定、細胞水平測定、細胞生物學、生物化學、體外同位素測定、穩定細胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術等，提供一套完整的生物學服務。了解服務詳情

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細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（PCD）是受基因控製的一種主動性細胞自殺過程，在形態學和生化有其明顯的特征，是有別於細胞壞死的細胞死亡方式。研究細胞凋亡的方法有很多，如形態學觀察，瓊脂糖凝膠電泳，原位末端標記法，流式細胞儀檢測等。

細胞凋亡時，形態上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內側顯新月體形，核碎裂；細胞體積變小，細胞漿和細胞器密度增高；線粒體正常或輕微腫脹；細胞膜皺折、卷曲，但早期細胞膜仍保持完整；細胞膜出泡，芽生形成膜包裹的凋亡小體，內含完整的細胞器和核碎片。在組織中，凋亡小體常迅速被鄰近細胞吞噬，由於細胞內容物不外溢，故周圍組織中無炎症反應。而細胞壞死時，細胞體積變大，線粒體明顯腫脹，在早期細胞膜的完整性即被破壞，胞漿內容物外泄，引起局部炎症反應或組織損傷。核的變化發生較晚，主要是核溶解和消失。無凋亡小體形成。

    形態學是鑒定細胞凋亡最可靠的方法，主要有普通光學顯微鏡觀察方法，透射電子顯微鏡觀察方法和熒光顯微鏡觀察方法等，以下介紹普通光學顯微鏡觀察方法中的HE染色法以及熒光顯微鏡觀察方法中的吖啶橙染色法和吖啶橙/EB染色法。

細胞凋亡檢測方法

方法一 蘇木素——伊紅染色（HE染色法）
【原理】蘇木素容易被氧化，其氧化產物蘇木紅與鋁結合形成一種帶正電荷的藍色色精，與帶負電荷的脫氧核糖核酸酸根吸附而使細胞核染色。染色後必須進行分化（differenciation）和藍化（blueing）處理。所謂分化，就是用某些試劑，將過度染色的或不需著色的組織成分上的顏色除去。所謂藍化是指用明礬蘇木素液深染細胞核後，通過鹽酸乙醇分化，切片從酸性環境中（此時，切片呈紅褐色）轉移至流水中使之變藍的過程。
伊紅Y（四嗅熒光素二鈉鹽）是一種酸性染料，可使細胞的胞漿染成粉紅色。

方法二 吖啶橙染色法
【原理】吖啶橙是最經典的靈敏的熒光染料，它可通過與DNA和RNA的連接堿基對和磷酸鹽基團結合，使細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光。吖啶橙在稀溶液中呈綠色；在濃溶液中，由於出現二聚體和多聚體而呈現橙紅色。由於DNA是高度聚合物，吸收熒光物質的位置較少，故發綠色熒光；而RNA聚合度低，能和熒光物質結合的位置多，故發紅色熒光。

方法三 吖啶橙/EB雙染色法
【原理】用吖啶橙染色可以檢測細胞凋亡，但不能區別活細胞和死細胞。溴化乙錠（EB）僅著染死細胞，可使DNA染成桔紅色，而僅很弱地結合RNA使之呈紅色。因此將吖啶橙和溴化乙錠混合使用，可根據兩種染料的吸收情況鑒定死細胞和活細胞。

方法四 瓊脂糖凝膠電泳法
【原理】在細胞凋亡過程中，內源性核酸內切酶被激活，該酶優先作用於連接DNA的核小體間區域，將DNA鏈切割成為180～200bp或其整倍數的片段。將這些DNA片段抽提出來進行瓊脂糖凝膠電泳，即可出現梯狀電泳圖譜。壞死細胞的DNA隨機降解，並伴組蛋白的降解，故在凝膠電泳時呈模糊、彌散膜狀條帶。

方法五 原位末端標記技術
細胞凋亡中，染色體DNA的斷裂是一漸進的分階段的過程，其首先在內源性核酸水解酶的作用下降解為50~300kbp的DNA大片段。然後大約30%的染色質DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，從核小體間將DNA鏈切割成為180～200bp或其整倍數的寡核苷酸片段。染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，並通過一定的顯示係統使之顯示出來，從而可對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，所以很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，並可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學法和DNA ladder測定法要高，且能早期顯示尚未發生典型形態變化的凋亡細胞，是檢測單個細胞早期出現凋亡現象的較好方法，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
【原理】在TdT酶的作用下，生物素（biotin）標記的dUTP可以參入到凋亡細胞DNA斷鏈的3'-OH末端，並可與連接了過氧化物酶（POD）的親和素（streptavidin）特異結合，POD可催化底物DAB產生很強的顏色反應，特異準確地定位凋亡細胞，因而在普通光學顯微鏡下，即可觀察和計數凋亡的細胞。

方法六 亞G1峰檢測法
【原理】處於增殖周期中的細胞，根據其所處不同周期時相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之間。凋亡細胞的重要特點就是細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解。在乙醇固定和去垢劑處理後，凋亡細胞的細胞膜通透性增加，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，以DNA特異性熒光染料染色後，形成一個DNA含量小於2n（即小於G0/G1期細胞）的分布區。 用流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（Sub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak, 也叫凋亡峰）。代表凋亡細胞。根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。

方法七  Annexin V-FITC凋亡檢測

    【原理】正常活細胞帶負電的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表麵，暴露在細胞外環境中。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結合。以標記了FITC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和發生繼發壞死的細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。將Annexin Ⅴ與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及繼發壞死的細胞區分開來。

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