ADC藥物解讀（三）| 一文解析ADC藥物研發難點

2022-07-19

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ADC藥物結構複雜多樣化，以及體內作用和代謝過程複雜性，這些為CMC研究、臨床前研究等帶來多重挑戰。不同的腫瘤微環境不同，靶蛋白不同，對於ADC藥物來說選用何種抗體、小分子毒素、連接子、連接方式等都需要進行特異性考慮。泛偶聯時代，每一款偶聯藥物，都應該結合自身特點找準定位，形成差異化競爭策略，走創新化的研發之路，滿足未被滿足的臨床需求。

❖ ADC藥物設計要素

ADC是由抗體+連接子+小分子毒素三部分構成的複雜結構，這決定了它的製備工藝也會更為複雜。在製備和生產過程中，需要經曆多個合成步驟，溶於多種溶劑，小分子毒素需要在這些過程中保持化學結構和性質穩定。ADC藥物的成功通常取決於以下五大要素的設計：

靶向抗原

靶向抗原的選擇是ADC藥物設計的關鍵一環。需滿足：

1、特異性，腫瘤細胞高表達、正常細胞低表達或不表達；

2、靶向抗原需為腫瘤細胞表麵抗原；

3、高效誘導內在化過程（internalization）等。

理論上ADC藥物可在腫瘤細胞外釋放毒素，不經過細胞內在化，通過“旁觀者效應”對腫瘤細胞造成殺傷。但實際上目前大部分ADC藥物療效的實現均是以內在化後的藥物釋放為基礎。因此，ADC藥物中的抗體和腫瘤細胞表麵抗原結合後，ADC-抗原複合物需能有效誘導內在化過程，進入腫瘤細胞內，並通過適當的細胞內轉運和降解過程，實現小分子藥物的有效釋放。

細胞免疫熒光Confocal檢測ADC內在化.png

通過細胞免疫熒光Confocal檢測ADC內在化

抗體

ADC藥物中的抗體需要：

1、對所選抗原具有高度特異性。若缺乏特異性可能會造成脫靶毒性或被過早清除；

2、與靶向抗原的高親和力；

3、低免疫原性，從而保證ADC藥物在血液中有較長循環時間以及順利進入腫瘤細胞。

連接子

連接子包括不可裂解（non-cleavable）連接子和可裂解（cleavable）連接子兩種類型。連接子需要考慮穩定性和釋放效率的平衡。不可裂解連接子更具穩定性優勢，可裂解連接子釋放效率更高。

偶聯技術

偶聯技術通過連接子將抗體和小分子毒素連接到一起，涉及化學反應、抗體修飾與改造等相關技術。ADC藥物所采用的偶聯技術與其最終的藥物抗體比率（Drug to Antibody Ratio；DAR）密切相關，而DAR的數值及其分布會顯著影響ADC藥物性質。DAR過大可能導致ADC藥物聚集，進而在循環係統中被清除；DAR過小，可能導致ADC藥物無法達到最佳治療效果。DAR在2~4之間是ADC藥物的最優選。目前，常用的偶聯技術可分為隨機偶聯和定點偶聯兩大類。DS-8201采用定點偶聯技術，藥物抗體比高達8，具有更好療效。

小分子毒素

小分子毒素是ADC藥物發揮殺傷活性的主要成分。在選擇小分子毒素時需綜合考慮毒性、可修飾性等多個因素：1，與一般化藥相比，具有更高毒性；2、可修飾性；3、適當的親疏水平衡；4、高穩定性等。

❖ ADCC&CDC作用

ADC藥物進入血液後，其抗體部分識別並結合靶細胞的表麵抗原；隨後ADC抗原複合物由內吞通路介導進入細胞。在細胞內，可裂解連接子對腫瘤細胞內的微環境敏感，會受 pH 值影響，或者被蛋白酶及某些化學物質裂解；攜帶不可裂解連接子的 ADC 藥物被溶酶體消化，從而釋放藥物。某些 ADC 藥物的小分子可以穿透細胞膜進一步殺傷周圍的腫瘤細胞，即旁觀者殺傷效應。此外，ADC 還具備 ADCC、CDC等抗體的免疫效應。

ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）是一種抗體依賴的細胞毒性作用，是免疫係統對抗病毒感染及腫瘤疾病的一種重要免疫防禦機製。一般為自然殺傷細胞（NK）介導（有時中性粒細胞和嗜酸性粒細胞也能介導ADCC作用），抗體Fab端結合靶細胞表麵抗原，Fc端結合NK細胞表麵的Fc受體CD16，將靶細胞與NK細胞拉近距離，並激活NK細胞釋放顆粒酶和穿孔素等，最終導致靶細胞被裂解。

CDC（complement dependent cytotoxicity）是一種補體依賴的細胞毒性作用，由血清中大量存在的一係列補體蛋白 (C1-C9) 介導。C1q 與細胞表麵抗體分子的 Fc 結構域結合而觸發CDC反應。補體通過特異性抗體與細胞膜表麵相應抗原結合，激活補體經典途徑，形成的攻膜複合物裂解靶細胞的作用。許多抗腫瘤抗體，如針對 CD20、CD52、人白細胞抗原 (HLA)-II 類、癌胚抗原 (CEA)、糖脂抗原等產生的抗體可誘導 CDC反應。

ADCC和CDC作用機製.png

ADCC和CDC作用機製^[1]

❖ 雙靶點ADC

研究發現，雙靶點 ADC 比兩種單靶點ADC聯合給藥具有更好的治療效果。雙靶點 ADC 形式在治療難治性乳腺癌和其他腫瘤方麵非常具有潛力。比如，由Sutro Biopharma和EMD Serono共同開發的M1231是一款靶向EGFR和MUC1的雙特異性抗體ADC。M1231通過可裂解的Val-Cit SUTRO鏈接子與Hemiasterlin細胞毒素相連。Hemiasterlin 是一種三肽，通過與微管蛋白結合發揮其細胞毒性，從而破壞正常的微管動力學。

再比如，下文中科研人員通過設計帶有疊氮化物和甲基四嗪基團的新支鏈連接子作為正交點擊反應位點。加上有效載荷模塊（包括作為點擊對的 DBCO 或 TCO、PEGn、GluValCit 可裂解接接子、PABC 基團和毒素分子 MMAE 或 MMAF）。合成了具有雙效載荷的均質 ADC。GluValCit 連接子係統確保了 ADC 在體內的功效，同時最大限度地降低了動物血漿中連接子的過早降解。選擇 MMAE 和 MMAF 的雙重偶聯物使 ADC 能夠靶向作用於多種乳腺癌細胞。

雙靶點ADC分子設計和偶聯策略.jpg

雙靶點ADC分子設計和偶聯策略^[2]

❖ ADC旁觀者效應

ADC 藥物通過抑製腫瘤DNA複製或阻滯細胞周期誘導腫瘤細胞死亡。ADC藥物進入血液循環後，與腫瘤細胞表麵靶向抗原受體結合，形成ADC抗原複合物，被腫瘤細胞內吞，進而經過溶酶體降解，細胞毒素在胞內釋放，結合至DNA小溝或微管蛋白，抑製腫瘤DNA複製或阻滯細胞周期，誘導腫瘤細胞死亡。疏水性小分子毒素還可以通過細胞膜擴散，對鄰近腫瘤細胞產生殺傷活性，稱為旁觀者效應。

ADC藥物的旁觀者效應示意圖.jpg

ADC藥物的旁觀者效應示意圖^[3]

SYD985 和 T-DM1 都是靶向HER2 的ADC藥物，SYD985 因其更強的旁觀者效應而在細胞毒性測定中更有效。KRCH31 細胞是 HER2 陽性，ARK-4 細胞是 HER2 陰性，兩種細胞係進行共培養（用染料標記），然後進一步進行 FACS 分析細胞死亡。數據顯示，SYD985會導致旁觀者細胞（ARK-4）的殺傷。如下圖所示，當使用SYD985處理 KRCH31 細胞與 ARK-4 共培養時，KRCH31 的殺傷力沒有增加，但 KRCH31/ARK-4 的共培養使HER2 低/不表達的 ARK-4 細胞的旁觀者效應顯著增強。當使用 T-DM1處理 KRCH31/ARK-4 共培養物96 時，檢測到最低程度的旁觀者細胞毒性。

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體外旁觀者效應^[4]

hjc黄金城生物團隊擁有200多腫瘤癌細胞係，多種可供選擇的ADC靶蛋白表達陽性和陰性的腫瘤細胞。此外，hjc黄金城生物團隊擁有豐富的細胞標記經驗及基於 FACS 的細胞活力分析能力。

❖ ADC藥物CMC研究

包括4部分：

1、抗體；

2、載藥-連接子中間體；

3、ADC原料藥；

4、製劑部分。

此外還需要引入一些特殊的質量控製指標。如藥物與抗體的比率，載藥與抗體的連接位點以及ADC藥物中的藥物負載分布等。此外，ADC中遊離的載藥和抗體需要進行量化控製，載藥連接抗體後對抗體和靶點結合效力的影響以及ADC在人體血漿中的穩定性也需要進行研究。

❖ ADC臨床前研究相關種屬的選擇

一般情況，整體ADC的毒性研究可在一種動物種屬中進行研究。同時需要考慮其中小分子化合物和抗體藥物的雙重屬性。如果小分子化合物為新化合物或者毒性特征不明確，則至少需要在一個相關動物種屬中對其毒性進行單獨考察，可以單獨開展試驗，也可以在ADC的毒性研究中設置單獨給藥組。如果小分子化合物為已上市藥物，無需對其毒性進行單獨研究。若抗體部分靶向全新的靶點或者具有特殊安全性擔憂時，應考慮采用轉基因動物或替代分子對抗體的靶向藥理作用、Fc效應，以及靶向釋放小分子化合物所帶來的潛在毒性反應進行研究。hjc黄金城可幫助客戶完成：ADC藥物的血漿穩定性及體外溶血試驗、藥效學研究、藥代動力學、毒性研究、及安全性評價等全套研究。

❖ hjc黄金城ADC臨床前研發解決方案

hjc黄金城在ADC的臨床前一體化研究方案製定中與客戶深入交流，科研骨幹將每一個案例的特點與多年實戰經驗和技術積累相結合，謹慎地將優質實驗方案與結果提交到客戶手上。截至目前，hjc黄金城承接的IND申報類生物藥大項目已經100多項；包括單抗、雙抗、多抗、ADC、病毒疫苗和融合蛋白等。截至2022年5月，hjc黄金城已成功助力10個ADC藥物獲批臨床，並有多個ADC項目在研。hjc黄金城已完成毒素小分子：DM1，MMAE、Exatecan、Dxd，SN38等。hjc黄金城已完成靶點：Her2、Her3、Trop2、Claudin 18.2、CD33、Muc1、FR等。