疫苗被認為是針對傳染病的最有效的全球衛生幹預措施之一，當下和未來的疫苗研發都麵臨著更加有效和多樣化的保護反應以及越來越嚴格的安全係數的挑戰。開發新疫苗方法和製劑的主要挑戰是增加有效的免疫激活，導致保護性應答，同時限製過度的炎症。為了增強免疫反應，研究人員已經研究了Toll樣受體激動劑作為疫苗佐劑，因為它們可以激活先天免疫係統，促進多種免疫基因的表達，包括對T細胞重要的炎性細胞因子和細胞表麵受體。有效的TLR激動劑可刺激所需的細胞或體液適應性反應，並已成功開發出幾種疫苗，然而無法直接調節炎症增加了疫苗成本並延緩了其應用。現在有多種成功的TLR激動劑可用於疫苗，但是新的和高劑量的TLR激動劑麵臨的挑戰之一是過度活化或全身分布引起的過度炎症。
改善佐劑反應是開發針對某些病原體疫苗的最有希望的途徑，佐劑開發中的一項最大的挑戰就是調節炎症反應，同時保持免疫激活和保護作用。目前尚無批準具有獨立調節炎症和保護作用能力的佐劑。在這裏，研究人員展示了一種增強保護反應同時限製炎症的方法。為了實現這一目標，研究人員將部分選擇性核因子κB（NF-kB）抑製劑與幾種目前的佐劑聯合使用，所得疫苗可減輕全身性炎症並增強保護性反應。研究人員證明了這種方法可以增強保護，並且該方法已在多種佐劑和抗原中進行了測試，不僅可以減少炎症，還可以增強對流感、HIV等病毒的保護性反應，最終也可以用於開發新冠疫苗，該項研究成果近日發表在《Science Advances》上。
檢查CpG誘導的炎症和產生的免疫反應
研究人員試圖驗證SN50可以使抗原呈遞細胞上調細胞表麵受體，同時限製促炎細胞因子的產生。將小鼠骨髓的來源樹突狀細胞與SN50和CpG或CpG單獨孵育了6小時，並分析了增效劑如何改變細胞因子的產生和細胞表麵受體的表達。細胞內細胞因子染色顯示，用SN50處理的細胞表現出表達TNF-α和IL-6的細胞明顯減少。同時，CD86表達顯著增加並且CD40表達持續。因為p65-p50二聚體是在靜息細胞中發現的最豐富的二聚體，並且參與炎症細胞因子的產生，所以推測通過抑製該二聚體可以在限製炎症細胞因子的同時實現細胞表麵受體的轉錄和翻譯。
用模型抗原OVA和免疫佐劑SN50進行的體內疫苗接種（來源：Science Advances）
在觀察到SN50可以限製炎症而不降低體外細胞表麵受體的表達後，研究人員接下來想在體內研究這種作用。為了確定對NF-κB的抑製是否可以降低與CpG疫苗接種相關的促炎細胞因子TNF-α和IL-6的全身水平。在人體中，全身性TNF-α與局部副作用（例如注射部位腫脹和疼痛）相關，全身性IL-6與疫苗接種後的全身係統副作用（例如疲勞和頭痛）相關。此外，這兩種細胞因子在全身分布時均充當熱原，會導致發燒反應。研究人員在所有組中注射後1、3、6、24和48小時測量了這些促炎細胞因子，以確定響應CpG疫苗接種時細胞因子達到峰值的時間點。為了確定SN50如何影響體液反應研究人員在第28天分析了血清抗體水平，為了廣泛確定SN50的添加如何影響抗體水平使用酶聯免疫吸附測定來測量總Ig（G + A + M）。與單獨的PBS相比，CpG組的抗OVA抗體增加了2.4倍。接種了CpG + SN50的小鼠比PBS組增加了5.9倍，而CpG組增加了2.7倍。這些數據證實了添加SN50會增強下遊的適應性反應，從而導致免疫增強。由於疫苗接種後適應性反應的增加和耐受性的改善，研究人員將SN50歸類為免疫增強劑。
體內流感激發模型的免疫增強
接下來研究人員將重點關注SN50如何過渡到具有病毒挑戰的疫苗。研究人員選擇流感疫苗作為概念驗證疫苗，是因為它具有通用性，並且相對容易操作。研究人員試圖確定SN50是否會減少與強佐劑相關的副作用，並觀察這種改變對全身細胞因子的保護作用。研究人員在2017/2018流感季節使用Fluzone四價疫苗注射給小鼠，有無CpG（50μg）作為免疫佐劑，有500μgSN50（SN50H或50μgSN50（SN50 L）作為免疫佐劑免疫增強劑。Fz + SN50組的TNF-α水平低於單獨Fz。在所有組中，添加SN50可使TNF-α和IL-6的水平降低至與安慰劑組一致的水平。為了檢查SN50是否可以減輕接種疫苗的副作用，研究人員分析了接種後24、48和72小時的體重變化百分比。體重減輕是小鼠副作用最客觀的度量，到24小時時，接種Fz和Fz + SN50的小鼠平均損失0.85和0.75％，Fz + CpG組平均損失5.9％。在第72小時，Fz組的體重為起始體重的-1.1％，而接種Fz + SN50的小鼠體重增加了+ 1.5％。Fz + CpG組的體重減輕了起始重量的-1.6％，添加SN50 H導致體重減輕（變化0％），添加SN50 L導致體重減輕了-1.3％。總體而言，具有SN50的小鼠比沒有SN50的小鼠體重減輕得更少，這表明SN50降低了與疫苗接種相關的副作用，並提高了疫苗的耐受性。
流感挑戰模型（來源：Science Advances）
在第28天，研究人員分析了血清中血液中的抗體水平，Fz和Fz+ SN50之間的血清IgG濃度無顯著差異，Fz樣品和Fz+CpG之間有2.9倍的顯著差異。接種CpG的組之間無顯著差異，這表明添加SN50可以減輕炎症和疫苗接種的副作用，提高耐受性，同時保持抗體濃度。接下來，研究人員試圖確定在疫苗中加入SN50是否會增強對Fluzone的保護。在此階段沒有對小鼠施用任何額外的SN50，因此隻有疫苗誘導的適應性免疫反應和隨後的加強免疫可以起到保護小鼠免受流感的作用。在Fz+CpG中添加SN50可提供同等的保護，同時可改善初次接種疫苗的副作用和耐受性，在Fz中添加SN50可提供等同於Fz+CpG組的增強保護。這表明SN50除了提高耐受性外，還可以增強疫苗的適應性免疫潛能。
新疫苗佐劑的耐受性和保護性通常被認為是兩個具有反比關係的相互依賴的變量，其中通過限製耐受性獲得了足夠的保護，反之亦然。由於這種增強劑使疫苗既安全又更具保護性，研究人員想要尋求一種單一方法來分析SN50如何改變耐受性和保護性。由於這些變量被認為是負相關的，因此很少有相關的先例。遵循評分係統的先例，研究人員開發了一個容忍度與保護度的關係圖，該圖僅用作本研究中收集的所有數據的直觀表示。在疫苗接種中包括SN50的所有組均增加了耐受性和疫苗保護性。綜合所有數據後得出結論，SN50通過增加耐受性和改善疫苗接種的保護效果而充當免疫增強劑。
改善各種TLR和物種的佐劑反應
為了檢查SN50在各種TLR激動劑中的作用，研究人員對用SN50處理的RAW巨噬細胞進行了定量聚合酶鏈反應，然後用不同TLR的激動劑進行刺激。用SN50和脂多糖（LPS;10ng/ml）、CpG（5μg/ ml）、R848（1μg/ml）和Pam3CSK4（100ng/ml）刺激細胞，並將轉錄水平與TLR激動劑處理的細胞進行比較單獨使用。在RAW巨噬細胞中，研究人員觀察到TNF-α和IL-6的下調促炎細胞因子轉錄水平。與單獨的激動劑相比，在所有激動劑中細胞表麵受體CD86和MHCII轉錄水平均被上調。這與體內觀察結果相吻合，當在SN50與CpG一起使用時，淋巴結內cd86表達增加並且細胞活性增加，這表明增加T細胞反應和增加與T細胞中細胞遷移和細胞毒性相關的基因表達的相同作用對於大多數佐劑將維持不變。
多種佐劑的體內疫苗接種（來源：Science Advances）
為了檢查其在體內的翻譯方式，研究人員使用gp120作為抗原為小鼠接種了CpG（50μg）、Pam3CSK4（20μg）和R848（50μg），將這些佐劑與最廣泛使用的明礬（250μg）一起使用。使用CpG觀察到完全消除了全身性TNF-α和IL-6促炎細胞因子，使用R848和Pam3CSK4發現TNF-α和IL-6均顯著降低。僅明礬不會引起全身性細胞因子應答，並且添加SN50不會改變細胞因子譜。這些數據表明，SN50在廣泛的佐劑上可用於減輕全身性炎症，同時維持提高適應性反應，這證明了該係統對大量免疫佐劑具有廣泛的潛在用途。
為了了解這種效果如何轉化為人類疫苗，研究人員用含或不含SN50的LPS（1μg/ ml）處理了THP-1單核細胞。用SN50和LPS處理的細胞表達的TNF-α和IL-6水平明顯降低，還觀察到CD40和CD86的水平增加。用SN50和LPS或單獨的LPS刺激了NHP PBMC 6小時，並分析了細胞上清液中的促炎細胞因子，用LPS刺激的細胞在細胞上清液中顯示出高水平的TNF-α和IL-6，而具有SN50的細胞則顯示出細胞因子水平的顯著降低。因此與單獨用LPS刺激的細胞相比，用SN50和LPS刺激的細胞中CD86表達增加了兩倍，這意味著SN50在NHP和人類中的作用可能與在小鼠中的相似。
結果與討論
使用廣泛的TLR激動劑，在體內和體外均顯示NF-κBp50亞基的細胞可滲透抑製劑，增強免疫反應，減少炎症和副作用，同時增加抗體反應。CpG與免疫增強劑的共同給藥可導致全身促炎性細胞因子水平顯著降低，通常降至無法檢測的水平。同時，添加免疫增強劑導致模型抗原OVA抗體的IgG水平增加三倍，這表明有可能增強適應性免疫反應同時限製先天免疫係統引起的炎症。SN50是數百種類似的NF-κB增效劑之一，當與適當的TLR激動劑結合使用時，許多增強劑可用於引發針對不同疫苗或免疫療法的特異性和潛在可調性反應，該方法有潛力使更廣泛的模式識別受體（PRR）激動劑能夠安全地用於疫苗中，並擴大可安全施用佐劑的窗口。它還可能增加適應性免疫譜的多樣性，並擴大疾病的預防和治療範圍。
總而言之，研究人員已經證明將特定的NF-κB抑製劑與常見的免疫佐劑結合使用可以降低全身促炎性細胞因子的產生，同時提高細胞表麵受體的表達，從而在小鼠、人類和NHP原代細胞中有效地呈遞抗原並激活T細胞。在體內使用這種抑製劑可將全身性TNF-α和IL-6完全降低至基線水平，同時增加疫苗接種後的下遊適應性體液反應。有數百種已記錄的免疫佐劑可為疾病提供足夠的保護，但是無法獨立調節炎症和副作用限製了它們的使用。研究人員預計該框架將使各種TLR激動劑能夠安全地用於人類疫苗中，從而增加適應性免疫譜的多樣性，並擴大疾病的預防和治療範圍，同時這項研究也可能會有益於新冠疫苗的研發，尤其是當病毒突變成季節性病毒時。hjc黄金城在疫苗的安全性評價等方麵積累了多年的經驗，對於疫苗的研究也從未停下腳步，hjc黄金城會持續關注此項研究進展，希望可以為疫苗的優化和研發助力。
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