淺談hjc黄金城抗體藥物PK分析方法學設計的考慮要點

編者引言：單克隆抗體藥物進入體內有著多個可能的存在形式：遊離型、部分結合型、完全結合型。抗體藥物體內的多種存在形式使得其PK分析方法學設計較為複雜，如何考慮待測分子形式，如何針對性地設計出合適的Assay Format，實踐中又可能出現什麽樣的問題和挑戰，在本文中作者將進行詳細闡述。下麵就跟著小編一起往下看吧！

當前生物治療性產品中抗體藥物占主要部分，截至2017年，已經有60多個單抗藥物獲批上市，2017年全球銷售額排名前10的藥中，有8個是大分子藥物，這8個中單抗藥就占6個，目前超500種抗體藥物處於臨床開發階段，國內外抗體藥物開發的熱度近幾年來持續上升。這些抗體產品基本上都是IgG亞型的單克隆抗體。IgG是具有兩個抗原結合價的抗體亞型，這種二價性使得抗體藥物在體內有多種可能的存在形式：二價的即遊離型抗體（mAbfree），單價的即部分結合的抗體（Partial bound mAb），結合了兩個抗原的抗體即完全結合的抗體(Total bound mAb)。在進行血藥濃度檢測時，需要考慮是否有循環的、可溶性的抗體藥物靶向結合的配體分子(Ligand,L)存在，從而明確其多種可能的存在形式。如果抗體藥物靶向結合的配體是一個二聚體甚至多聚體，抗體藥物的存在形式可能更為複雜。鑒於抗體藥物體內存在形式的多樣性，可靠的分析方法學是支持PK/PD研究，評估劑量-反應關係，評價有效性和安全性的關鍵。

利用抗體的靶向配體分子即靶點分子作為捕獲試劑，以抗Human IgGFc的抗體作為檢測試劑的配對夾心模式是一種較為方便和節約的Assay Format設計（參見圖1）。這種Assay Format可以檢測兩種形態的抗體藥物，即部分結合的抗體（Partial bound mAb）與遊離抗體(mAbfree)，但不能檢測到完全結合的抗體，因此無法定量mAbtotal。若目標基質中明確不可能存在遊離靶點的幹擾或mAb*L複合物，運用此種Assay Format進行PK檢測的確是一種便利的途徑，且此時檢測抗體形式也僅可能是遊離抗體（mAbfree）。遊離靶點的存在，和給藥後mAb*L複合的形成，靶點的蓄積會幹擾此Assay Format對mAbtotal的檢測，但有研究人員提出將mAb*L酸化解離的方法使所有結合型mAb變成遊離的形式，從而達到基於此Assay Format能檢測mAbtotal的目的。也有研究人員將此方法進行改造，即采用包被有Streptavidin的固相材料，並將用於捕獲的靶點分子進行Biotin標記與酸化處理的樣品同步加入反應體係中達到盡可能定量mAbtotal的目的，這樣的操作流程類似於ADA檢測的Bridge ELISA檢測模式（參見圖２）。

    圖1：靶點捕獲測遊離與部分結合的抗體

    圖2：基於圖一的改造型靶點捕獲法

抗獨特型單克隆抗體是一種能夠識別、結合另一抗體可變區的抗體，在抗體藥物的藥代動力學分析上有較多的應用。在某一個特定的抗體分子中，其可變區中特異性的抗原表位部分，被稱為抗體的獨特位（idiotope）。對於某一個特定的抗體，存在著多個獨特位區域：有些獨特位和該抗體的抗原結合互補位完全重合；有些獨特位位於可變區的互補位之外；而另外一些獨特位，除了互補位之外，還包括了可變區上其它序列。一個抗體分子中所有獨特位和互補位統稱為該抗體的獨特型（參見圖３）,針對於某一個抗體分子獨特型部分的抗體，被稱為抗獨特型抗體（Anti-idiotype Atibody，Anti-id）。與抗原結合互補位結合的抗獨特型抗體具有抑製性或中和性，不與抗原互補位結合的抗獨特型抗體不具有抑製性和中和性。采用不同的抗獨特型抗體設計出不同的Assay Format可以針對性地檢測到各種形式的單克隆抗體藥物，即遊離、部分結合或完全結合抗原的單克隆抗體。

    圖3：抗體的獨特型與獨特位

以非抑製性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)作為捕獲試劑，並以非抑製性的抗獨特型抗體或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測試劑可以檢測所有的抗體形式（mAbtotal）(參見圖４,圖5)。以抑製性抗體(Inhibitory Anti-id) 或靶點分子分別作為捕獲試劑、檢測試劑配對模式構建橋式ELISA（Bridge ELISA），甚至靶點分子和抑製性抗體(Inhibitory Anti-id)配對使用可實現僅能檢測到遊離型抗體藥物。（參見圖6）。以抑製性的抗獨特型抗體捕獲試劑，非抑製性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測試劑可以檢測遊離和部分結合的單價抗體（參見圖7）。將抑製性的抗獨特型抗體或靶點分子作為捕獲試劑，采用標記mAb藥物與樣品中非標記mAb藥物競爭結合固相抗體的方法也可以檢測遊離和部分結合的單價抗體，將此種方法的捕獲試劑替換為非抑製性的抗獨特型抗體也可以檢測總的抗體藥物（mAbtotal），但競爭性的方法更較為難以獲得好的穩健性。

    圖4：基於Non-inhibitory Anti-id和抗Hu IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）檢測mAbtotal

    圖5：基於Non-inhibitory Anti-id作為捕獲和檢測試劑檢測mAbtotal‘’

    圖6：基於靶抗原分子配對作為捕獲和檢測試劑檢測mAbfree

    (說明:設計時將圖中的捕獲抗原和檢測抗原換成抑製型抗獨特型抗體，或其中一個抗原替代為抑製性抗獨特型抗體均可實現僅檢測mAbfree ，不再一一圖示)

    圖7：以抑製性和非抑製性抗獨特型抗體分別為捕獲和檢測試劑檢測mAbfree和單價抗體

對於結合型抗體藥物（部分結合和完全結合）的檢測，也可以采用與抗體藥物不具競爭性的抗靶點的抗體作為捕獲試劑，以非抑製性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測抗體的構成的Assay Format進行檢測（圖8）。也有文獻指出，在樣品中添加過量的遊離靶向配體分子將mAb轉變成mAb*L從而盡可能實現此Assay Format對mAbtotal的定量。

    圖8：以非抑製性抗靶點抗體為捕獲試劑檢測完全結合和部分結合抗體

前述不同Assay Format中的檢測抗體可以根據靈敏度需要或檢測模式的需要將HRP標記替換為其它不同的分子進行標記。雖然不同的Assay Format可以針對性地實現PK樣品中不同抗體藥物形式的檢測，但在實踐中仍然可能麵臨許多挑戰和問題值得思考。1）如抗獨特型抗體雖然可以較好地利用於PK生物分析中，但其製備和篩選有一定的周期和難度，更加消耗成本。2）酸化解離和將遊離mAb轉化為mAb*L雖可以將對mAb部分形態檢測的Assay format應用於mAbtotal的檢測分析，但酸化後的樣品在加入中和液後解離開的靶點分子還是可能與用於捕獲的靶點分子進行競爭，因此給操作上增加了控製難度，解離後的複合物存在著又結合回去的可能，酸化是一種促進檢測方法對遊離靶點的耐受性手段，但用於定量檢測的準確性還需要看方法的優化程度；抗原抗體反應具有可逆性，是一個動態平衡的過程，而遊離mAb即使在過量的靶向配體分子存在下也不可能全部轉化為mAb*L，此過程對mAbtotal定量的偏差程度需要有效控製在一定的範圍內，有其實踐中的複雜性。3）實踐中我們首先或更容易獲得的配製PK樣品分析標準曲線的是mAbfree，遊離的標準品製備的標準曲線在定量檢測結合型抗體完全合適嗎？含有與遊離mAb標準品等摩爾濃度或等質量濃度的抗體分子成分的mAb*L複合物在檢測過程中的反應能力和產生的信號強度一致嗎？是不是需要進行兩者的間的校正或要另外製備mAb*L複合物標準品呢？

另外，如果靶點配體分子與藥物結合外還可能與其它分子結合時，方法上如何設計和優化；如果靶點分子是二聚體或多聚體又會對PK分析產生什麽樣的挑戰；抗體藥物作為大分子藥物具有潛在的免疫原性，這又會對PK分析產生什麽樣的影響等等沒有列入此文的討論範圍。隨著各學科的發展，新的檢測技術出現和實踐的深入，未來對各種形態的抗體分子檢測會更加遊刃有餘。

• 【雲講堂】理論、法規、實踐，三位一體講解雙抗的生物分析

• 【雲回顧】理論、法規、實踐，三位一體講解雙抗的生物分析

• 【雲講堂】多肽類藥物生物分析的挑戰與對策

• 【雲回顧】如何做好多肽類藥物的生物分析？

Email: marketing@yakkaa.com
電話: +86 (21) 5859-1500（總機）