一文讀懂：蛋白降解靶向嵌合體 (PROTAC）

前 言

傳統小分子藥物的發現主要集中在直接影響蛋白功能的結合位點或者變構位點上，然而，這種方法通常無法靶向那些缺乏活性位點的蛋白，或活性位點是寬而淺的結合口袋而難以被小分子結合。因此，這類難以被傳統小分子靶向的蛋白通常被稱為“不可成藥”靶點。人類蛋白質組包含大約20000種蛋白，但隻有不到 1000種蛋白被驗證為藥物靶點，據估計，由於缺乏明確的配體結合口袋，約80%的疾病相關蛋白無法通過傳統藥物進行有效幹預。

蛋白降解靶向嵌合體 (Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC)，是一種新興的治療方式，它利用細胞的天然蛋白質降解機製，即泛素-蛋白酶體係統 (UPS) ，選擇性地靶向降解疾病發病機製中的相關蛋白，從而可能調節傳統小分子難以靶向的“不可成藥”靶點。因此，PROTAC分子的概念自2001年首次報道以來，受到了學術界和工業界的廣泛關注，經過PROTAC設計的多次創新和臨床前模型的嚴格評估，首批PROTAC分子ARV-110、ARV-471於2019年進入臨床研究。目前，全球共有近40個PROTAC分子已批準臨床試驗，涉及腫瘤和自身免疫疾病等適應症。其中，最前沿的PROTAC分子ARV-471於2022年底啟動了臨床III期試驗。

PROTAC的作用機製與優勢

PROTAC是由兩個通過連接子 (Linker) 連接的配體組成的異雙功能小分子降解劑：一個配體招募並結合目標蛋白 (POI) ，而另一個配體招募並結合E3泛素連接酶。PROTAC同時結合POI和連接酶，通過形成E3-降解劑-POI三元複合物誘導POI的多泛素化，並隨後被26S蛋白酶體降解，之後PROTAC分子將被回收利用，以靶向POI的另一個副本。

泛素-蛋白酶體係統^[1]

PROTAC介導的目標蛋白降解機製^[1]

與傳統的小分子藥物相比，PROTAC有幾個潛在的優勢，包括：

1) 傳統小分子藥物的研究通常集中在開發高親和力抑製劑上，這些抑製劑通常靶向蛋白的活性位點，或者靶向蛋白的變構位點，以關閉POI的功能（“占位驅動”藥理學）。然而，在許多情況下，小分子抑製劑需要和POI的天然底物競爭性結合，難以達到和維持有效抑製POI所必需的高局部藥物濃度。PROTAC的作用機製不是影響蛋白的功能，而是介導靶蛋白的降解（“事件驅動”藥理學），不需要強作用於活性位點，隻需要介導POI與E3泛素連接酶的短暫相互作用，誘導E3-降解劑-POI三元複合物的形成，從而靶向一些傳統上認為的“不可成藥”靶點。

2) 傳統小分子抑製劑必須保持其局部的高濃度才能發揮治療作用，而長期、高劑量的藥物暴露可能增加某些不良反應的風險，並引起累積毒性。而PROTAC“事件驅動”的作用模式，其循環催化能力使其能夠催化多個POI的降解，因此能夠在亞化學計量濃度下達到POI降解的目的，隻需要比較低的劑量就能達到和保持其藥效。此外，因為PROTAC催化並且不可逆地降解致癌蛋白，PROTAC具有更持久的治療效果。

3) 持續使用小分子抑製劑治療也可能誘導靶蛋白的突變及耐藥性。由於短暫的靶蛋白接觸足以使POI降解，PROTAC很可能不太容易受到warhead結合親和力降低的突變的影響，因此，PROTAC有可能克服此類小分子藥物耐藥性的問題。

2 PROTAC的發展曆程

自PROTAC概念於2001年由Sakamoto等人首次發表以來，已經取得了許多重要發展。對肽衍生的PROTAC降解劑、以及免疫調節亞胺藥物（IMiD）作為分子膠將底物連接到E3連接酶的發現，為高效的小分子PROTAC的發現和開發奠定了基礎。

在過去的幾年裏，蛋白降解領域經曆了爆炸式的增長，合理設計的靶向蛋白降解劑作為潛在治療藥物的時代始於2019年，兩種PROTACs進入首次人體試驗：ARV-110 （NCT03888612）和ARV-471（NCT04072952），分別靶向雄激素受體（AR）和雌激素受體（ER）。目前，是靶向蛋白降解的初始轉化階段，在這個階段，設計用於降解致病蛋白的多種分子正在進入臨床，有望能夠為患者提供臨床益處。

PROTAC發展的關鍵進展時間表^[2]

3 PROTAC的臨床研究進展

自2019年兩種小分子PROTAC降解劑進入臨床試驗後，許多其他小分子PROTAC也陸續進入臨床研究，主要用於腫瘤的治療研究，此外還涉及免疫炎症性疾病、神經退行性疾病等適應症。截至目前，國內外共有近40個PROTACs已進入了臨床研究階段，研究較多的靶點包括AR、ER、BTK、EGFR、IRAK4等。然而，盡管有很好的臨床前研究成果，很大一部分PROTAC在推進人體臨床試驗過程中也遇到了挑戰，目前還沒有PROTAC獲批上市。

全球PROTAC管線臨床研發進展

4 PROTAC的設計

PROTAC的基本化學組成包括：結合並招募E3連接酶的E3配體、結合POI的配體和連接E3和POI配體的Linker。

PROTAC的設計，主要從如下幾個方麵考慮：

(1) 靶點選擇 

根據PROTAC獨特的、“事件驅動”的作用機製，靶點的選擇通常可以參考如下6項原則：

1) 經典的“不可成藥”靶點。傳統上“不可成藥”靶點，如KRAS、信號傳導及轉錄激活蛋白3 (STAT3) 等，已有報道成功地使用蛋白降解劑進行了降解。

2) 耐藥突變靶點。腫瘤靶向治療的耐藥性通常是由於突變導致的，這些突變或者損害了傳統小分子抑製劑與靶蛋白的結合和/或導致靶蛋白的過度表達（原則3），以至於藥物不能再獲得足夠的療效。PROTAC可以成功地靶向這類靶蛋白，如BTK的C481S突變，BTK中的C481S突變阻止了臨床上BTK抑製劑的共價結合活性，但這些抑製劑的弱非共價結合親和力足以衍生為活性PROTAC。

3) 基因擴增和/或蛋白過表達。如轉移性去勢抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 對雄激素受體 (AR) 的持續依賴，由抗雄激素治療的突變和過表達驅動，再加上該靶點已知的臨床有效性，因此，臨床研究中的PROTAC很多選擇AR作為靶點。

4) 具有不同異構體表達或定位的靶點。由於蛋白家族中異構體結合位點的高度同源性，用小分子抑製劑實現異構體選擇性具有一定的挑戰性，而研究發現即使選擇非選擇性靶蛋白結合配體設計的PROTAC，也可能表現出異構體的特異性降解，例如從雙重CDK4/6抑製劑中開發出選擇性CDK4或CDK6降解劑。

5) 腳手架蛋白。腳手架蛋白通過招募其他蛋白形成複合物而轉導信號，而不是通過自身的催化活性來發揮其功能，因此很難用傳統的小分子直接靶向。然而，這類蛋白可以用蛋白降解劑靶向。

6) 蛋白聚集。蛋白質聚集與神經退行性疾病有關，包括阿爾茨海默病和帕金森病，蛋白降解方法也正在這一領域進行探索。

(2) E3連接酶的選擇

為了設計有效的PROTAC，關鍵是要選擇對E3連接酶具有足夠結合親和力的E3配體，並且在不影響其泛素化活性的情況下招募功能活躍的E3連接酶，然而這種E3配體的可用性是有限的。在人類基因組中編碼了600多種E3連接酶，迄今為止隻有大約10種E3連接酶被成功用於靶向蛋白降解。

目前，靶向蛋白降解劑廣泛使用的兩種E3連接酶是 von Hippel-Lindau (VHL) 和cereblon (CRBN) ，主要原因包括：首先，VHL和CRBN可以使用現有的、容易獲得的小分子結合配體，且具有適合Linker連接的結構位點；其次，VHL和CRBN可以靈活穩定地降解各種靶蛋白；第三，VHL和CRBN的表達相對普遍，能夠實現高水平的係統性蛋白降解。

常用的基於沙利度胺的CRBN配體和可能的Linker連接方式^[3]

常用的VHL配體和可能的Linker連接方式 ^[3]

除了CRBN和VHL之外，其他常見的E3配體還包括IAP及MDM2，E3連接酶的新配體的發現和開發也正在進行中，如RNF4、RNF114、DCAF16、KEAP1、DCAF11和FEM1B等。由於不加區分的係統性靶蛋白降解可能導致不可接受的毒性和相對狹窄的治療指數，組織特異性或腫瘤特異性E3連接酶的配體開發受到越來越多的關注。通過靶向腫瘤特異性E3連接酶，特異性地降解腫瘤組織中相關蛋白，原則上可以提高PROTAC的耐受性。

(3) POI配體設計

POI配體的選擇對於PROTAC的成功設計也是至關重要的。通常，選擇POI配體的溶劑暴露區域作為Linker連接位點，以盡量減少Linker和E3配體對PROTAC-POI結合的幹擾。

PROTAC的設計可利用已報道的靶蛋白結合配體，這些配體最初被設計為靶蛋白抑製劑。隨著對新的靶蛋白降解的探索，特別是傳統的“不可成藥”靶點，識別新的靶點-蛋白結合配體的需求增加。DNA編碼庫 (DEL) 技術是一種可用的蛋白降解劑的配體鑒定和開發的方法，DEL技術篩選的原理中，配體結合位點和蛋白功能活性無關，且在沒有更多的結構支持的情況下，能夠提供一種潛在的Linker連接位點（即DNA條碼標記位點）。DEL技術在發現新的分子膠降解劑、E3連接酶配體等方麵也有潛在的用途。

(4) Linker設計

靶蛋白與E3連接酶配體之間使用的Linker類型和長度是至關重要的，通常使用不同長度的烷基或聚乙二醇 (PEG) Linker，以確定靶蛋白和E3連接酶之間的最佳距離。由於蛋白之間的空間位阻，Linker太短會阻止高效三元複合物的形成；太長的Linker可能會使三元複合物失去蛋白降解活性。在某些情況下，Linker在三元複合物中不隻起到連接作用，還可以與蛋白表麵形成接觸。

一些研究已經證明，Linker的構象約束可以通過降低自由度或鎖定生物活性構象來進一步提高活性。構象限製性Linker已被開發用於係列SMARCA2/4降解劑、AR降解劑、及ER降解劑ARV-471等。此外，還可通過Linker的結構設計，來調節PROTAC的藥代動力學性質。

5 PROTAC藥物開發的難點與挑戰

雖然PROTAC具有變革藥物發現領域的潛力，然而，由於其結構特性的固有缺陷，對PROTAC的臨床轉化構成了重大挑戰，限製了其臨床應用：

1) 由於E3泛素連接酶在正常組織和疾病部位的非選擇性表達，導致PROTAC的脫靶活性，從而可能引起副作用的發生。

2) PROTAC分子量（>800 Da）相比於傳統小分子藥物要更大，通常水溶性較差，往往導致較低的生物利用度。

3) PROTAC的高極性表麵限製了分子的滲透性，極大地阻礙了PROTAC分子透過細胞膜和生理屏障。

4) 細胞內較高濃度的PROTAC傾向於形成POI-降解劑的二元複合物，而不是形成三元複合物，產生Hook效應，從而降低靶蛋白的降解活性，並阻礙了其體內劑量的合理設計。

PROTAC的主要局限性 ^[4]

6 新一代PROTAC

雖然通過結構修飾有望克服PROTAC的某些限製，但同時優化其理化性質以能夠有效地在體內應用，這是一個巨大的挑戰。新一代PROTAC的設計可能解決這些難題，而不是僅僅依賴於過度的化學優化。這類新一代PROTAC在特定組織受到外源性或內源性刺激後，恢複POI降解的功能，而在其他組織保持無活性狀態，從而有望實現高度靶向治療，減少副作用。

例如：
(1) 點擊釋放性PROTAC (Click-release PROTAC)
(2) 酶響應性PROTAC (Enzyme-responsive PROTAC)
(3) 穀胱甘肽響應性PROTAC (GSH-responsive PROTAC)
(4) 低氧響應性PROTAC (Hypoxia-responsive PROTAC)
(5) 光激活性PROTAC (Photo-activatable PROTAC)
(6) 輻射響應性PROTAC (Radiation-responsive PROTAC)
(7) 活性氧響應性PROTAC (ROS-responsive PROTAC) 等

❖ 點擊釋放性PROTAC的開發 ，有望克服傳統PROTAC分子量較大的限製，然而，因為每個前體分子表現出不同的PK性質，需要考慮這些前體的體外反應活性和合適的分子比例。

❖ 光激活性PROTAC的一個主要限製因素是紫外光缺乏足夠的組織穿透能力，這阻礙了這些光激活PROTAC前藥的開發和應用。為了解決這個問題，科研人員探索開發了一種在實體腫瘤中激活PROTAC前藥的替代策略，利用內源性特征，如缺氧、GSH和ROS等水平升高來激活PROTAC，以實現精準的蛋白降解。

雖然這些方法具有較大開發潛力，但在PROTAC前藥設計中需要設計額外的響應部分，不可避免地導致PROTAC分子量的增加，這可能會給它們的成藥性帶來新的挑戰。

新一代PROTAC設計中使用的策略^[4]

配體修飾 

新一代PROTAC還可通過配體修飾，從而選擇性靶向特定細胞，如葉酸 (Folate-targeting PROTAC) 、抗體 (Antibody-PROTAC conjugate) 和適配體 (Aptamer-PROTAC conjugate) 等。

由於這類配體修飾的PROTAC，能夠選擇性地結合癌細胞表麵表達的特定受體或生物分子，有效地將降解劑特異性地輸送到腫瘤組織，最大限度地減少對健康組織的暴露，因此已成為腫瘤細胞靶向蛋白降解的潛在治療藥物。

然而，設計有效的配體修飾PROTAC前藥需要仔細考慮幾個因素：
❖ 選擇合適的配體，對其靶受體表現出高親和力和選擇性，是實現最佳治療效果的關鍵；
❖ 確保循環穩定性，防止在到達病變組織之前過早降解或喪失活性；
❖ 合理的配體設計，促進有效釋放活性PROTAC內化到癌細胞。
總之，需要仔細控製釋放的時間和程度，以最大限度地提高治療效果，同時盡量減少潛在的不良反應。

納米顆粒遞送係統

此外，納米顆粒遞送係統也可能成為一種有效的替代策略，如調節PROTAC的水溶性、細胞滲透性和改善體內藥代動力學性質，以及增強PROTAC在病變組織中的積累，減輕蛋白質降解劑的組織外靶向副作用，以達到更好的治療效果。用於藥物遞送的納米顆粒大致可分為有機納米顆粒和無機納米顆粒，有機納米顆粒進一步分為聚合物納米顆粒和脂質納米顆粒。

盡管具有很大的潛力，PROTAC納米顆粒遞送係統仍然麵臨著一些限製其廣泛應用的挑戰：

❖ 確保藥物遞送係統中使用的載體材料的生物相容性，應仔細評估和選擇在體內使用安全且不會引起不良反應或毒性的材料, 在優化效果的同時確保其副作用在可接受的範圍內；

❖ 另一個重要的考慮因素是質量控製的可靠性，由於這些遞送係統涉及複雜的配方和工藝，因此在整個生產過程中建立健全的質量控製措施至關重要；

❖ 額外的載體材料和藥用輔料可能會增加PROTAC的生產成本，應評估生產工藝的放大可行性和成本效益，以確保有效的大規模生產而不影響產品質量。

總結與展望

PROTAC降解劑的開發在過去的幾年中得到了迅速發展，包括從藥物化學設計和結構優化，到臨床前實驗的活性評估，再到臨床研究的驗證。臨床前數據的報道，有力地證明了PROTAC對其靶點的特異性，以及抑製腫瘤生長的活性。此外，臨床前數據表明，蛋白降解劑對小分子抑製劑治療後產生的耐藥性突變具有活性。盡管還缺乏足夠臨床數據，但PROTAC已顯示出對晚期前列腺癌、乳腺癌或慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者的療效，包括分別具有AR、ER和BTK耐藥突變的患者。PROTAC分子的療效和安全性，在更大的患者群體中進行探索是非常有必要且有益的。

由於PROTAC研究較多及前沿的靶點，包括靶向AR、ER或BTK的ARV-110、ARV-471和NX-2127等，這些靶點此前已在疾病的發病機製中驗證了其作用，下一步的關鍵是要確定PROTAC技術是否能夠真正實現經典的“不可成藥”靶點的降解。比如，目前在臨床I期研究中的STAT3降解劑KT-333、KRAS G12D 降解劑ASP-3082，分別用於複發和/或難治性淋巴瘤和晚期實體瘤、晚期KRAS G12D 突變實體瘤患者的治療。除了在癌症的治療應用，PROTAC技術也可用於靶向參與其他疾病發展的蛋白，例如靶向IRAK4降解用於自身免疫性疾病的治療，從而提供更廣的治療潛力。

此外，蛋白降解劑的靶向遞送，可能實現最大限度地減少全身遞送的潛在毒性。目前，已經報道的各種遞送係統，包括抗體-PROTAC偶聯物等，可以在腫瘤中被光、葉酸或活性氧等選擇性激活，以實現PROTAC的靶向遞送。

盡管PROTAC在臨床前和臨床中都顯示出治療潛力，但PROTAC的開發也麵臨著挑戰，如患者是否會對蛋白降解劑產生耐藥性。目前，臨床前的研究報道有限，迄今為止的大多數蛋白降解劑耐藥性的產生是通過影響泛素-蛋白酶體係統的改變，例如E2泛素結合酶的功能喪失、E3泛素連接酶的組分或E3連接酶活性的調節因子，而不是靶蛋白的改變。一項臨床前研究顯示，藥物外排泵MDR1的上調是對蛋白降解劑產生耐藥性的機製之一。需要對長期使用蛋白降解劑治療的患者進行評估，以確認臨床前觀察到的耐藥機製是否也會發生在臨床中。

總而言之，在過去的二十年裏，PROTAC經曆了從實驗室到臨床研究的漫長旅程，在2019年首次進入臨床開發，初步臨床數據的結果表明PROTAC具有用於癌症治療的潛力，更多關於PROTAC的臨床研究正在進行中。除了PROTAC之外，其他靶向蛋白降解技術也正在開發，包括同樣基於泛素-蛋白酶體係統的分子膠、及基於溶酶體係統的溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC) 和自噬靶向嵌合體 (AUTAC) 等，這些技術擴展了TPD的範圍，為疾病的治療提供了廣闊的前景。

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