美研|CMC係列(十六)：淺析HILIC模式對大極性化合物的應用

HILIC模式簡單介紹

HILIC是一種色譜分離技術-親水作用色譜（hydrophilic-interaction chromatography）的簡稱，也稱為非水反相色譜或者反反相色譜，由Alpert教授於1990年提出，並將HILIC模式和正相模式（NPLC）進行了區分^[1]。

HILIC模式和正相有著類似的洗脫方式，由於使用了反相溶劑係統（水和有機相），從而具備正相所沒有的優勢，例如係統中可以含水，對於化合物的稀釋劑選擇更多，重現性更好，可以連接MS進行聯用等等（HILIC模式含有高比例有機相，相比於水相更多的反相，更容易去溶劑化，增加離子化效率，提高靈敏度，如圖1所示）。HILIC模式可以避免使用離子對試劑，對於大極性化合物的製備很有益。HILIC模式廣泛應用於大極性化合物的分離，例如藥物、糖類、蛋白、多肽、氨基酸等等。

圖1：不同模式對化合物的應用範圍

HILIC模式作用機理

HILIC的保留機製是液液分配、吸附作用、離子相互作用和親水性保留作用等多種模式作用的綜合體現，化合物的保留一般受其化學性質和結構、固定相和流動相作用以及流動相種類（有機溶劑種類以及流動相pH）影響。

HILIC模式的色譜柱的固定相采用未衍生化矽膠或雜化顆粒、酰胺基、氨基、二醇、兩性離子、環糊精類、聚琥珀酰亞胺鍵合物質等極性填料，所以化合物的保留強度和其極性成正比，和流動相極性成反比。極性溶劑的存在可以使固定相表麵形成一層極性層，如圖2所示，因此對於利用液液分配作用進行保留的化合物，流動相中極性溶劑是必不可少的，一般至少包含3%極性溶劑 ^[2]。

圖2：胞嘧啶在流動相和固定相表麵吸附水層液液分配

在流動相中添加緩衝鹽和添加劑也是常用手段，有助於改善峰型和保留，緩衝鹽在麵對固定相表麵極性層和非極性溶劑時，更加傾向於溶解於極性層，隨著鹽濃度增加從而增加其親水性， ^[3]。

其中，甲酸銨和乙酸銨是最常用的緩衝鹽，這得益於它們在有機溶劑中良好的溶解性以及MS兼容性。需注意的是，隨著鹽濃度的提高，化合物和固定相的離子作用會受到抑製，主要作用為液液分配 ^[4~7]，這就導致堿性化合物的保留減弱，是因為大量的陰離子和堿性化合物配對形成中性離子對更容易溶於有機相；相反，酸性化合物保留則會增加，是由於帶負電的矽醇離子排斥作用減弱，從而與固定相作用增強。

一些固定相填料表麵上具有帶電矽醇，具有一定酸性，在pH5~9時，矽醇基團就處於電離狀態，對於帶電狀態的化合物離子交換作用將扮演重要角色 ^[3]。需注意的是，由於HILIC模式下具有高比例有機相，高或低pH的緩衝鹽溶於其中時，其真實pH值會由緩衝鹽pH值向中性靠近1~1. ^[8]，使化合物處於電離狀態的pH值，更利於化合物的保留。

一般酸性化合物在高pH（常用氨水、碳酸氫銨等）條件下保留強於低pH條件，堿性化合物在低pH（常用乙酸、甲酸、乙酸銨、甲酸銨等）條件下保留較好。

HILIC模式溶劑選擇

HILIC模式洗脫溶劑強度為：四氫呋喃 < 丙酮 < 乙腈 < 異丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水（由弱至強），如圖3所示，四氫呋喃、丙酮和乙腈洗脫能力最弱，可作為主要溶劑使用，由於丙酮的截止波長330nm過高，在UV檢測器使用受限（可用於CAD、ELSD、MS等），而乙腈是非質子溶劑，能夠增加化合物和固定相表麵極性層的氫鍵作用，從而增加保留，因此作為最常用流動相之一，相當於反相中的水相，水的洗脫能力最強，常作為洗脫溶劑使用，可根據化合物保留情況選擇合適的洗脫溶劑。

圖3：HILIC模式洗脫溶劑強弱順序

HILIC模式注意事項

01 稀釋劑

一般建議選擇流動相起始比例溶解樣品。由於HILIC模式乙腈的比例較高，很多大極性化合物難以溶解，為了保證化合物溶解，通常會將大極性溶劑——如水、甲醇等應用於稀釋劑。在這種情況下和常規反相分離類似，HILIC模式使用強洗脫稀釋劑時也會導致溶劑效應問題。而二甲基亞碸（DMSO）作為稀釋劑，具有一定保留，並且DMSO在低波長下有較強的吸收，可能會影響目標化合物出峰，一般配合乙腈、甲醇使用，DMSO比例一般不超過25%。

常規可以考慮使用75%的乙腈和25%的甲醇混合液作為稀釋劑，也可以加一些添加劑助溶，如甲酸等。需注意的是，樣品的含水量如果過大，也會影響化合物出峰情況。

02 洗針液

由於大極性化合物的保留極易受大極性洗脫試劑的影響，有時洗針液中的殘留清洗溶劑會對化合物出峰產生影響，或者方法難以重現，一般建議采用流動相起始比例洗針。

03 流動相

為保證在分析過程中離子強度的穩定，可以在水相和有機相均加入同樣濃度的添加劑，也可以考慮預混，需注意的是，在流動相配製過程中，混合後常常會產生溫度變化，使用前需放置至室溫。

04 色譜柱再生

色譜柱使用一段時間後，樣品可能會殘留在柱頭堵塞柱篩板，這時可以考慮采用高濃度緩衝鹽低流速進行反衝。以默克色譜柱SeQuant® ZIC-HILIC為例，首先采用30倍柱體積的超純水進行衝洗，再用30倍柱體積的緩衝鹽（可以用500mM乙酸銨溶液）進行衝洗，最後再用30倍柱體積的超純水進行衝洗，不同填料處理可能不同。

HILIC模式方法開發

對於未知化合物方法開發，可采用如圖4所示的一般思路進行。需注意的是由於HILIC模式化合物保留方式特殊，固定相的極性水層來源於流動相，梯度不能變化過快，柱平衡需要留一定時間。

圖4：HILIC模式未知化合物方法開發一般思路

對於已知化合物，則可以根據化合物性質進行選擇，首先判斷酸堿性，可以用ACD進行模擬，從而進行色譜柱的選擇。

表1 色譜柱填料及應用範圍

hjc黄金城經典案例

01 胺類化合物

氨丁三醇在常規反相體係下沒有保留，並且沒有紫外吸收，遂采用HILIC模式，選擇CAD檢測器進行方法開發。氨丁三醇峰型良好，對稱因子1.2（如圖5所示），線性相關係數r 可做到1.000，回收率在97%~104%之間。

圖5：氨丁三醇典型圖譜

02 氨基酸檢測

氨基酸大多是小分子兩性化合物，在常規反相分離模式下保留很弱，通常采用衍生法進行檢測，比如說賴氨酸，其 pKa 和 logD 見下圖：

圖6：賴氨酸 pKa

圖7：賴氨酸 logD

賴氨酸的 logD 在所有條件下都是負值，常規反相體係無法產生保留行為，我們采用HILIC模式解決了賴氨酸的分析檢測，得到了良好的保留（8min）和峰型（拖尾因子1.6），大大降低分析成本，便於方法轉移和檢測（如圖8所示）。

圖8：賴氨酸典型圖譜

03 大極性雜質

對於沒有保留、沒有紫外吸收、不能碰水、極性和主成分接近的雜質，該如何分析呢？hjc黄金城給出的答案是HILIC-MS模式。如葡甲胺的發補雜質中有一個席夫堿，該化合物極性大、沒有紫外吸收、見水易分解，該雜質和葡甲胺極性接近，常規方法難以分離。

采用HILIC-MS模式進行方法開發，最終葡甲胺和該席夫堿雜質分離度在2.8以上，線性相關係數r為1.000，200ppm的LOD信噪比最小為25，回收率在94%~103%之間，且方法耐用性良好，各參數微小變化下，均可達到1.5以上基線分離，回收率在98%~102%之間。

圖9：分離度溶液典型圖譜

hjc黄金城分析測試中心

hjc黄金城已建立完善的分析測試中心，可以采用豐富的設備和多種先進的技術（高分辨、LCMSMS、GCMSMS、CAD、NMR、離子色譜、雙三元等等）滿足客戶的各項分析需求！

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（撰稿：李墨；編審：杜建，畢增）

參考資料：

[1] Alpert, A. J., J. Chromatogr. 1990, 499, 177-196.
[2] Waters親水作用色譜, Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain
[3] Jandera, P., J. Sep. Sci. 2008, 31, 1421–1437.

[4] Strege, M. A., Anal. Chem. 1998, 70, 2439-2445.
[5] McCalley, D. V., J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46-55.
[6] Naidong, W., J. Chromatogr. B 2003, 796, 209-224.
[7] Liu, M., Ostovic, J., Chen, E. X., Cauchon, N., J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362-2370.
[8] Fountain, K. J., Xu, J., Diehl, D. M., Morrison, D., J. Sep. Sci. 2010, 33, 740-751.

美研|CMC係列回顧

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