美研|CMC係列(十四)：離子色譜的使用原理及其在藥物研發中的應用

摘要

現代離子色譜（Ion Chromatography）技術起源於上世紀70年代，它的開始源於H.Small及其合作者的工作。離子色譜是高效液相的一種，是分析陰、陽離子、小分子極性有機物（酸堿）等的一種液相色譜。離子色譜在藥物分析中的應用補充了液相色譜和氣相色譜對離子型藥物分析的不足，可用做離子化合物及其雜質的定性與定量研究，已成為藥物質量研究與質量控製的手段之一。

在實際的方法開發與應用中離子色譜可以連接多種類型的檢測器，例如電導檢測器、電荷檢測器、安培檢測器和光學檢測器等^[1]。其具有靈敏、快速、準確度高和選擇多樣性的有點，逐漸獲得了很多研究人員和技術人員的青睞，其被廣泛應用到環境、食品、飲料、工業、醫療衛生、藥物研發、化工、電子、生命科學和農業等領域。

關鍵詞：離子色譜；藥物質量研究；定性與定量分析

在藥物研究的過程中，離子色譜常用作對離子型化合物的分析和定量研究。離子化合物，是由陰離子（Anion，帶負電）和陽離子（Cation，帶正電）組成，其本質上是庫侖力的離子鍵相結合的化合物。離子化合物通常熔點和沸點較高，熔融時或電離產生其組成離子的水溶液中時能導電。大部分離子化合物在常溫下是固體。

對於適用於離子色譜檢測的常見類型陽離子，主要包括第一主族和第二主族的堿金屬和堿土金屬和部分的過度金屬元素，活潑金屬離子（如鋰鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子等）；常見類型陰離子，主要包括鹵素離子、有機和無機酸根離子（如氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、甲酸根、三氟乙酸根、硝酸根和硫酸根等），其在水溶液條件下可導電，其常用電導檢測器原理為可連續檢測流出物的電導變化。

01 離子色譜的基本組成

01 進樣係統

進樣器是是將樣品送入色譜柱的裝置，是離子色譜儀進行化合物分析的重要組成部分。自動進樣器包括進樣臂、進樣針、樣品盤、清洗係統、驅動係統以及控製係統等部分組成，各個部分之間緊密合作，共同帶動著自動進樣器的正常運行。特別說明進樣針為PEEK材質，具有耐腐蝕等優點，但材質較為脆弱，樣品瓶蓋需使用預開口蓋。

02 泵模塊

輸液泵為離子色譜儀提供動力，是液相的核心部件。根據泵的工作原理又可以分為串聯式雙柱塞往複泵、並聯式雙柱塞往複泵和單柱塞往複泵，材質為耐壓耐腐蝕的PEEK材料（色譜柱正常使用壓力一般小於20MPa），具有輸出壓力高、耐腐蝕、流量穩定、噪音低等優點。

03 淋洗液發生係統

生成淋洗液（流動相）的關鍵模塊，區別於液相色譜的專有模塊，常用陰離子檢測發生罐為氫氧化鉀淋洗液發聲罐；常用陽離子檢測發生罐為甲基磺酸淋洗液發生罐，為電解池原理，通過控製電流大小而得到相應濃度的淋洗液係統。優點是所得淋洗液潔淨度高、對背景影響小、濃度準確、無需人為配製淋洗液。

04 抑製係統

抑製係統是離子色譜的核心部件之一，主要作用是降低背景電導和提高檢測靈敏度。抑製器的好壞關係到離子色譜的基線穩定性、重現性和靈敏度等關鍵指標。

① 柱－膠抑製：采用固定短柱或現場填充抑製膠進行抑製，不同的抑製柱交替使用，屬於間歇式抑製。
② 離子交換膜抑製：采用離子交換膜，利用離子濃度滲透的原理進行抑製。需要配製硫酸再生液，係統需要配置氮氣或動力裝置。
③ 電解自再生膜抑製：利用電解水產生媒介離子和離子配合離子交換膜進行抑製（最佳選擇）。

05 分離及檢測係統

分離係統是色譜體係的重要模塊，其使用色譜柱常包括兩部分組成。

① 保護柱：保護柱與分析柱填料相同，消除樣品中可能損壞分析住填料的雜質。如果不一致，會導致死體積增大、峰擴散和分離度差等。
② 分析柱：分離樣品組分。離子色譜常用分離模式有三種，分別是離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對色譜[2]。

檢測係統由抑製器和檢測器兩部分組成，抑製器的主要作用是通過電解抑製或化學抑製的方式降低檢測背景值，提高待測離子的響應：

① 檢測器主要為電導檢測器，是通過測定溶液流過電導池電極時的電導率，電導率越大，電阻率越小，電阻率與電阻成正比，電阻越小電流值越大，電導檢測器是基於極限摩爾電導率應用的檢測器，主要用於檢測無機陰陽離子、有機酸和有機胺等；
② 另一種檢測器為安培檢測器，安培檢測器是基於測量電解電流大小為基礎的檢測器，主要用於檢測具有氧化還原特性的物質，安培檢測器分為主適用於抗壞血酸、溴、碘、氰、酚、硫化物、亞硫酸鹽、兒茶酚胺、芳香族硝基化合物、芳香胺、尿酸和對二苯酚等物質的檢測的直流安培檢測器、適用於醇類、醛類、糖類、胺類（一二三元胺，包括氨基酸）、有機硫、硫醇、硫醚和硫脲等物質的檢測用於醇類、醛類、糖類、胺類（一二三元胺，包括氨基酸）、有機硫、硫醇、硫醚和硫脲等物質的檢測的脈衝安培檢測器以及在脈衝安培檢測器基礎上升級的積分安培檢測器。

06 離子色譜儀的管道係統

管道材料有PEEK管（高壓區）、PTFE管、矽膠管（氣路或廢液用）、各種接頭和連接配件。

02 離子色譜儀的工作流程

高壓輸液泵將流動相以穩定的流速（或壓力）輸送至分析體係，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導入，流動相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，並依次隨流動相流至檢測器。

抑製型離子色譜則在電導檢測器之前增加一個抑製係統，即用另一個高壓輸液泵將再生液輸送到抑製器。在抑製器中，流動相背景電導被降低，然後將流動出物導入電導池，檢測到的信號送至數據處理係統記錄、處理或保存。

03 離子色譜的基本流路

04 離子色譜電解抑製器的抑製原理

在離子色譜的抑製法分析過程中，使用的淋洗液是強電解質，在不使用抑製器的情況下，背景電導高，靈敏度差。

以陰離子分析為例，陰離子抑製器的作用是將高電導的淋洗液轉變成為低電導的弱酸或水，從而提高檢測的靈敏度。比如常用的淋洗液是Na2CO3-NaHCO3混合溶液和KOH，都是強電解質，其電導比較高，而電導檢測器是一種通用性檢測器，選擇性相對較差，對進入電導池的導電物質都有電導響應，就是說淋洗液和待測離子都有電導響應，這樣在高的淋洗液背景電導下待測離子的電導信號就相對小了。如果要提高檢測靈敏度，就需要將淋洗液轉變為低電導的物質，抑製器就是來完成這個任務的，將其連接在柱與電導池之間，在樣品經色譜柱分離後，將淋洗液和待測離子轉變為相應的酸，比如：Na2CO3-NaHCO3轉變為碳酸；KOH轉變為水；Cl-、SO42-轉變為鹽酸、硫酸。

這樣下來，淋洗液變成了弱酸，使得背景電導大幅降低。而待測離子的陽離子被轉換成了H+，H+的極限摩爾電導是350μS，比Na+、K+等陽離子的極限摩爾電導高他們分別是50μS和74μS。檢測器檢測的是陰陽離子的電導之和，這樣轉化成的HCl比原來樣品中的NaCl、KCl電導響應提高了。從而提高了檢測靈敏度。總結一下就是，經過陰離子抑製器後背景電導大幅下降而待測離子的響應電導上升，從而提高了檢測靈敏度。

05 離子色譜常見問題及解決辦法

01 背景抬高

① 淋洗液用超純水汙染。解決辦法：更換淋洗液用超純水，去離子水電導率一般為18.2兆歐姆；
② 方法參數設置不當。解決辦法：檢查實驗方法，淋洗液選擇對應用淋洗液，抑製器電流設定應與所用淋洗液濃度匹配；
③ 抑製器故障。解決辦法：檢查抑製器循環水出口是否有連續的氣泡產生，抑製器有無漏液等情況，若無連續氣泡產生或由漏液情況，則應及時更換抑製器。

02 分析泵常見故障

基線的噪聲加大，色譜峰形變差。解決辦法：通常為泵內產生氣泡或漏液，嚐試手動排氣泡操作。

03 抑製器常見故障

抑製器在離子色譜儀中具有舉足輕重的作用。抑製器工作性能的好壞對分析結果有很大的影響。抑製器最常見的故障是漏液，使峰麵積減小（靈敏度下降）和背景電導升高。

① 峰麵積減小
造成峰麵積減小的主要原因有：微膜脫水、抑製器漏液、溶液流路不暢和微膜被玷汙。抑製器長期不用，會發生微膜脫水現象，為激活抑製器，可用注射器向陰離子抑製器內以淋洗液流路相反的方向注入少許0.2mol/L的硫酸溶液。同時向再生液進口注入少許純淨水，並將抑製器放置半小時以上。抑製器內玷汙的金屬離子可以用草酸鈉清洗。

② 漏液
抑製器漏液的主要原因是抑製器內的微膜沒有充分水化。因此，長時間未使用的抑製器在使用前應讓微膜水溶脹後再使用。另外要保證再生液出口順暢，因此反壓較大時也會造成抑製器漏液。另外抑製器保管不當造成抑製器內的微膜收縮、破裂也會發生漏液現象。

③ 背景電導值高
在化學抑製型電導檢測分析過程中，若背景電導高，說明抑製器部分存在一定的問題。大多數是操作不當引起的。例如淋洗液或再生液流路堵塞，係統中無溶液流動造成背景電導偏高或使用的電抑製器電流設置的太小等。膜被汙染後交換容量下降亦會使背景電導升高。而失效的抑製器在使用時會出現背景電導持續升高的現象，此時應更換一支新的抑製器。

06 案例分享

案例一 某多肽藥物中有機胺吡啶殘留的測定（陽離子模式）

在多肽藥物的合成中，常用FOMC作為氨基保護基團，而脫去FOMC常用呱啶、DMF脫去，而呱啶作為殘留溶劑需在中間過程或終產品中進行質量控製，呱啶是純粹碳鏈供電子共軛,因此其堿性較強，常規的GC檢測方法峰型較差，易產生殘留和拖尾等問題。

陽離子模式下檢測呱啶分析方法

陽離子模式下檢測呱啶（係統適用性）

係統適用性6針重現性良好，保留時間RSD為0.1%，峰麵積RSD為2.3%，不對稱因子1.1，連續進樣係統無呱啶殘留。滿足驗證RSD要求。

陽離子模式下檢測呱啶（線性）

0.2032μg/ml~2.0320μg/ml線性範圍良好，線性相關係數r值0.9999，加標回收率98.9%~101.1%之間。

案例二 葡萄糖中葡糖酸含量測定，限度0.1%（陰離子模式）

葡萄糖上的醛基進一步氧化為羧基即生成葡糖酸，其特點為易溶於水、幾乎無紫外吸收、極性大、沸點高等，常規的HPLC、GC等檢測方式無法滿足低限度的分析檢測。

陰離子模式下檢測呱啶分析方法

陰離子模式下檢測葡糖酸（係統適用性）

係統適用性6針重現性良好，保留時間RSD為0.3%，峰麵積RSD為0.9%，不對稱因子1.0，連續進樣係統無葡糖酸殘留。

陰離子模式下檢測葡糖酸（線性）

2.6062μg/ml~15.6369μg/ml線性範圍良好，線性相關係數r值0.9993，加標回收率91.6%~95.6%之間。

案例三 某API為鹽酸鹽化合物（陰離子模式鹽酸鹽含量測定）

某IND申報藥物，API為鹽酸鹽化合物，水溶性較差，溶液顏色複雜，經研究成鹽比會影響其晶型，氯離子含量需嚴格控製在8.7%~9.3%之間。

鹽酸鹽含量檢測（係統適用性）

通過離子色譜法測定氯離子含量，方法具有極其優秀的重現性，可通過樣品的前處理方式處理化合物溶解性較差等問題，溶液具有顏色等問題對離子色譜法檢測無影響。

鹽酸鹽含量檢測（線性）

5.0000μg/ml~15.0000μg/ml線性範圍良好，線性相關係數r值0.9999，含量回收率99.5%~901.0%之間。

參考文獻：

[1]牟世芬.朱岩.劉克納.離子色譜法及其應用.北京: 化學工業出版社，2018.3.
[2] 傅若農.色譜分析概論M.北京: 化學工業出版社，2005.3.

美研|CMC係列回顧

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